一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法与流程

本发明涉及一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，属于化学分析。

背景技术：

1、透明质酸(ha)是一种由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰基-d-葡萄糖胺通过β-(1-3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单元组成的线性多糖，每个双糖单元通过β-(1-4)糖苷键与另一个双糖单元连接起来。由于ha具有良好的保湿性、润滑性、黏弹性、非免疫原性以及对药物吸收的促进作用，因此在临床上得到了广泛应用。但是天然的ha存在水溶性强、在组织中易扩散和被酶降解、体内存留时间短等缺点，而经修饰和交联后得到的ha衍生物则可弥补这些缺陷。一些交联ha产品已被成功应用于预防术后粘连、治疗骨关节炎、软组织填充、组织工程和药物控释。

2、透明质酸一般以盐形式存在，即大多数情况下通过透明质酸钠进行使用。交联剂是用于透明质酸钠交联的物质，例如说1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)。交联反应是大分子包含空间多位点的复杂反应。交联透明质酸钠的理化性质与交联度的大小密切相关。交联透明质酸钠是交联透明质酸钠上糖环活性基团与交联剂在一定条件下反应，交联形成的凝胶大分子，是交联ha衍生物的一种。交联透明质酸钠的交联度是指其分子间通过化学键结合的程度，交联度越高分子间的结合越紧密，材料的稳定性和耐用性就越好，体内降解速率相对来说就会越慢。但同时交联度过高会导致材料僵硬，失去一定的弹性和柔软性。因此，交联度是控制交联透明质酸钠产品质量的指标之一。

3、中国专利文献cn107561179a提供了一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，公开了通过透明质酸酶酶解交联透明质酸或其盐，生成寡糖和二糖；再用液相色谱联合紫外吸收，分离和检测所述寡糖和二糖的色谱峰面积；最后经计算得出交联度。但是该专利方法需要先确定凝胶的酶解产物，检测过程中用到的精密仪器较多，过程繁琐，因此不适合工业生产过程中对产品质量的快速把控。

4、中国专利文献cn114280193a提供了一种凝胶交联度的检测方法，公开了根据凝胶酸解后的丙三醇浓度来计算凝胶的交联度，包括绘制丙三醇标准工作曲线、测定样品中丙三醇浓度以及计算样品的交联度等三个步骤。然而该专利方法存在以下几个明显的缺陷：第一、其测定过程中将凝胶样品酸解后于50～60℃下蒸干，再进行超声提取，但是蒸干后的样品状态坚硬且不易磨成粉末状态，超声提取过程中会损失部分的酸解样品，导致测试结果不准确。第二、该专利提取过程的超声时间过短的话，提取不完全；超声时间过长的话，提取溶剂易损失且影响溶液稳定性，导致测试结果不准确。第三、该专利的提取溶剂为无水乙醇，酸碱中和过程中产生大量的无机盐，部分未蒸干的水分及无机盐会溶解在无水乙醇中，进样采集的过程中会使仪器响应变低甚至无响应，既会导致测试结果不准确，还会损伤色谱柱。第四、该专利酸解温度为室温到100℃，实际检测时100℃以下酸解效果并不明显，导致测试结果不准确。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法。本发明的测定方法相较于现有技术检测过程更加简单，结果更为准确。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，包括步骤如下：

4、(1)供试品溶液制备

5、将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解12～36h，冷却至20～30℃后中和至中性，再进行冻干，得到冻干样品；然后将冻干样品使用乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清，过滤后，得到供试品溶液；

6、(2)丙三醇标准溶液制备

7、将丙三醇标准品用乙酸乙酯逐级稀释，得到不同浓度的丙三醇标准溶液；

8、(3)交联度的检测

9、将供试品溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液和丙三醇标准溶液的峰面积，然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中丙三醇的浓度；最后根据样品中丙三醇的浓度计算样品的交联度，计算公式如下：

10、

11、式中：

12、c丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/ml；

13、v——加入乙酸乙酯的体积，ml；

14、ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/ml计；

15、ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，mg/ml；

16、m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；

17、92.094——丙三醇的相对分子质量；

18、401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量。

19、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述酸解为：向交联透明质酸或其盐凝胶中加入氢溴酸或硫酸，在120～130℃下酸解18～24h。

20、进一步优选的，所述氢溴酸或硫酸的浓度为0.4～1m；所述交联透明质酸或其盐凝胶与氢溴酸或硫酸的质量体积比为(2～3)：(5～10)，单位：g/ml。

21、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述冻干的具体程序为：在-30℃预冻5～10h，升温至-10℃保持2～5h，再升至-2℃下保持2～5h，继续升至20℃保持6～10h，最后升至40℃保持20～45h，将样品中的水分除尽。

22、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述交联透明质酸或其盐凝胶与乙酸乙酯的质量体积比为(2～3)：(10～20)，单位：g/ml。

23、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述萃取的时间为5～10min；所述离心为在8000～14000r/min下离心5～10min。

24、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述丙三醇标准溶液的浓度设置为6～96μg/ml中的系列浓度。

25、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述气相色谱条件如下：

26、色谱柱：rbx-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250～270℃；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：270～290℃；流速：0.5～1.0ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：70～90℃，保持5min，以10～20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1。

27、有益效果：

28、1、本发明提供的检测方法将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解，改善了供试品溶解度低的问题，提高了检测结果的准确度。

29、2、本发明提供的检测方法将酸解后的交联透明质酸或其盐凝胶进行了冻干，得到的冻干样品状态松散，易提取，并且后续采用乙酸乙酯进行萃取提取，可以极大程度地降低无机盐和水在溶剂中的溶解度，增加了溶液稳定性和提取率，进一步地提高了检测结果的准确度。

30、3、本发明提供的检测方法优化了气相色谱条件，采用rbx-5色谱柱进行气相色谱，并设置分流比为1:1，有效改善了气相色谱峰型及分离度，更进一步地提高了检测结果的准确度。

技术特征：

1.一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，其特征在于，包括步骤如下：

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸解为：向交联透明质酸或其盐凝胶中加入氢溴酸或硫酸，在120～130℃下酸解18～24h。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述氢溴酸或硫酸的浓度为0.4～1m；所述交联透明质酸或其盐凝胶与氢溴酸或硫酸的质量体积比为(2～3)：(5～10)，单位：g/ml。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述冻干程序为：在-30℃预冻5～10h，升温至-10℃保持2～5h，再升至-2℃下保持2～5h，继续升至20℃保持6～10h，最后升至40℃保持20～45h，将样品中的水分除尽。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述交联透明质酸或其盐凝胶和乙酸乙酯的质量体积比为(2～3)：(10～20)，单位：g/ml。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述萃取的时间为5～10min；所述离心为在8000～14000r/min下离心5～10min。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述丙三醇标准溶液的浓度设置为6～96μg/ml中的系列浓度。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述气相色谱条件如下：

技术总结
本发明涉及一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，属于化学分析技术领域。本发明所述的检测方法是将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解，进行冻干，得到冻干样品；将冻干样品使用乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清，过滤后，得到供试品溶液；然后根据交联透明质酸或其盐凝胶酸解后的丙三醇浓度来计算交联透明质酸或其盐凝胶的交联度。本发明提供的检测方法通过提高酸解温度，并将酸解后的交联透明质酸或其盐凝胶进行冻干，后续采用乙酸乙酯进行萃取提取，可以极大程度地降低无机盐和水在溶剂中的溶解度，增加了溶液稳定性和提取率，有效地提高了检测结果的准确度。

技术研发人员：苏移山,刘超,朱希强,胡晓蝶,马丽娜,相世栋
受保护的技术使用者：山东丰金美业科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21