一种基于凝集反应的检测试纸及其测试方法与流程

本发明涉及体外诊断，尤其是涉及一种基于凝集反应的检测试纸及其测试方法。

背景技术：

1、免疫层析技术主要借助免疫层析试纸条完成，免疫层析技术不仅操作简便、检测快速、特异性强、稳定性好，而且携带方便，已广泛应用于临床诊断、食品安全、药物检测、环境污染等领域。

2、目前市面上的免疫层析试纸要有胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸等，市面上的试纸条大多为配套定量分析仪器使用的定量检测试纸条，并且，这些试纸条都是通过测试线信号的增大以实现检测的；也正是基于上述信号放大的原理，传统免疫层析试纸在做定性或者半定量检测时，其灰区较大，在临床上使用时容易引起假阴性或者假阳性结果，降低测试的准确度。

技术实现思路

1、为了降低免疫层析试纸的测试灰区，提高免疫层析试纸的灵敏度以及定性和定量的准确性，本技术提供一种基于凝集反应的检测试纸及其测试方法。

2、第一方面，本技术提供一种基于凝集反应的检测试纸的测试方法，采用如下的技术方案：

3、一种基于凝集反应的检测试纸的测试方法，包括如下步骤：

4、预处理步骤：制备含有检测样本的样本混合液，向所述样本混合液中引入被信号标志物标记的一抗，由此得到层析液；

5、层析步骤：使所述层析液通过层析到达信号检测区，所述信号检测区设置有用于捕获所述一抗的二抗，且，在所述层析液到达所述信号检测区域之前向所述层析液中引入双特异性抗体，所述双特异性抗体能够特异性捕获目标抗原，且，所述双特异性抗体能够特异性捕获所述层析液中的凝集化物料，所述凝集化物料为可发生凝集反应的物料；

6、检测步骤：对所述信号检测区进行检测，读取属于所述信号标志物的实测信号值，将所述实测信号值与所述信号标志物的标准信号值进行比对，基于比对结果对所述目标抗原在所述检测样本中的含量情况进行估算，所述标准信号值为所述信号标志物在标准浓度下测得的信号值。

7、在层析液到达显色区域之前向其中加入凝集化抗体，凝集化抗体捕获目标抗原发生凝集反应，而凝集反应得到的凝胶化物料会随着层析过程的进行继续向靠近显色区域处移动，并且凝集反应得到的凝胶化物料随着层析过程的进行其颗粒粒径逐渐增加，颗粒粒径较大的凝胶化物料会逐渐堵塞向显色区域移动过程中的供层析液和凝胶化物料通过的可用孔道，随着层析过程的进行，降低一抗和信号标志物被层析至信号检测区域处的浓度，使信号检测区域中的二抗能够结合的一抗和信号标志物降低，从而降低荧光信号的强度；通过与标准信号值做对比得到反应样本中的目标抗原的含量，从而用于制成定性、定量或者半定量的检测试剂。

8、凝集反应是一种血清学反应；颗粒性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。具体地，凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。

9、相对于传统层析方法中通过信标在测试线处的富集从而显出光信号，本技术的检测方法并不是和传统的试剂盒一样存在信号放大的效果；本测试方法通过凝集反应生成的凝胶化物料堵塞通向信号检测区域的孔道，使信号标志物不能顺利到达信号检测区中，是信号从有到无的过程；并且在堵塞孔道的过程中，一个孔道被堵塞就可以截留大量的信号标志物，并且堵塞程度与截留的信号标志物的量并不是简单的1：1的关系，因此，本技术的检测方法存在截留信号放大的机理，相对于现有技术中使用的免疫层析方法而言检测灰区更窄，灵敏度更高，将上述检测方法应用在试剂盒中后，相对于传统试剂盒的灵敏度会有数量级的提升。

10、并且，本技术中的测试方法无需使用单克隆抗体，并且重新引入的双特异性抗体的成本也不高，能够降低该测试方法的物料成本；并且，由于本测试方法无需进行偶联单克隆抗体的操作，能够降低应用此方法的试剂盒的生产工序，缩短研发周期；传统试剂盒在研发过程中往往需要投入很高的人力和物力在单克隆抗体等几种核心物料的筛选上，因此，应用本技术检测方法的试剂盒最终的成本可比传统方式降低60%-80%甚至更多。

11、优选地，所述目标抗原发生所述凝集反应的情况包括：

12、所述目标抗原通过与所述凝集化物料发生直接凝集反应而形成凝胶化物料；和/或，所述凝集化物料发生间接凝集反应而形成凝胶化物料。

13、优选地，所述目标抗原包括d-二聚体、肌钙蛋白、脑钠肽、c反应蛋白、降钙素原、白介素6、血清淀粉样蛋白a等中的任意一种。

14、优选地，所述凝集化物料包括红细胞、聚苯乙烯微球中的任意一种；当所述凝集化物料为聚苯乙烯微球时，聚苯乙烯微球上耦合有链霉亲和素或抗体，所述双特异性抗体通过与所述链霉亲和素或抗体发生免疫反应实现对所述聚苯乙烯微球的捕获。

15、当所述凝集化物料为红细胞时，所述目标抗原与所述凝集化物料发生的凝集反应是直接凝集反应。当所述凝集化物料为聚苯乙烯微球时，双特异性抗体通过与链霉亲和素或抗体发生免疫反应实现对聚苯乙烯微球的捕获是间接凝集反应。

16、本技术中的测试方法适用于检测所有能参与发生凝集反应的目标抗原，只要选取合适的凝集化物料，就能够在凝集反应生成的凝胶化物料的作用下，在层析过程中将信号标志物截留，降低信号检测区信号标志物的检测强度，实现对目标抗原的定性、定量检测。

17、第二方面，本技术提供一种基于凝集反应的检测试纸，采用如下的技术方案：

18、一种基于凝集反应的检测试纸，所述检测试纸包括加样区和层析区，所述加样区与所述层析区相连接，沿远离所述加样区的方向上，所述层析区上依次设有扩散区和信号检测区；

19、所述加样区设置有被信号标志物标记的一抗，所述信号检测区设置有用于捕获所述一抗的二抗，在利用所述检测试纸进行检测时，含有检测样本的层析液从所述加样区进入所述扩散区并经由所述扩散区向所述信号检测区层析；

20、所述检测试纸还包括双特异性抗体，所述双特异性抗体能够特异性捕获所述层析液中的凝集化物料，所述凝集化物料为可发生凝集反应的物料；所述双特异性抗体设置在所述加样区和/或所述扩散区。

21、通过选用能够发生凝集反应的凝集化物料与目标抗原反应生成凝胶化物料，降低传递到信号检测区的目标抗原的浓度，降低信号检测区的无需像现有技术中的检测试纸一样筛选特定的单克隆抗体来实现对目标抗原的检测，不仅能够降低检测试纸的应用工序、降低应用成本；而且，在实际的操作过程中，偶联单克隆抗体的难度最大、容错率较低、偶联效果也最不稳定，不利于检测试纸的稳定性和检测准确性，而本技术中的检测试纸却能够克服上述检测不稳定的问题，显著提高测试准确性。

22、优选地，所述双特异性抗体的浓度为0.1-5μg/ml

23、通过控制双特异性抗体的浓度，在实现对目标抗原定性分析的同时，也能够实现定量、半定量分析。

24、优选地，所述一抗包括鸡igy、兔igg中的任意一种。

25、优选地，所述一抗的浓度为0.1-5μg/ml。

26、通过控制一抗的浓度，使转移到信号检测区上的一抗能被二抗充分地检测到，提高测试灵敏度。

27、优选地，所述信号标志物包括胶体金、胶体碳、荧光微球、彩色微球等免疫层析标记物中的任意一种。

28、本测试方法中使用的信标物质来源易得，降低测试方法的应用成本。

29、优选地，所述二抗包括兔抗鸡igy、羊抗兔igg中的任意一种。

30、优选地，当所述一抗为鸡igy时，所述二抗为兔抗鸡igy；当所述一抗为兔igg时，所述二抗为羊抗兔igg。

31、优选地，所述层析区的孔隙率沿所述层析液的层析方向逐渐减小。

32、当层析区的孔隙率沿着层析液的层析方向逐渐减小时，凝胶化物料随着层析过程的进行逐渐被堵塞在层析区中，从而降低一抗层析到信号检测区处的含量，进一步增强因凝胶化物料的出现而使信号检测区的测试线处出现光信号减弱幅度较大，测试效果显著。

33、优选地，所述层析区的细孔孔径为5-12μm。

34、优选地，本技术提供的一种基于凝集反应的检测试纸，包括pvc底板1和设置于所述pvc底板1上的样品垫2、结合垫3、nc膜4和吸水垫5，所述样品垫2、所述结合垫3、所述nc膜4与所述吸水垫5两两依次搭接，所述nc膜4上设置有测试线41；所述样品垫2和所述结合垫3对应所述加样区，所述结合垫3与所述测试线41之间的所述nc膜4对应所述扩散区，所述测试线41对应所述信号检测区。