一种分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法

本发明属于分析化学，更具体地，涉及一种分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法。

背景技术：

1、核酸是抗肿瘤化疗药物的重要靶点。而临床使用的重要的化疗药物如柔红霉素等通过嵌入结合dna影响dna的复制和转录，导致dna损伤等机制来杀死肿瘤细胞。此外，共价结合dna的药物如顺铂等通过交联dna，导致肿瘤细胞的死亡。传统的靶向核酸化合物面临毒副作用和耐药性的多种问题。除了抗肿瘤药物开发以外，结合rna的小分子化合物成为第一个上市的治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy简称：sma)的小分子化合物。这些也说明开发新型的核酸结合化合物在多种疾病的治疗中有潜在的意义。

2、天然产物一直是创新药物的重要源泉。据newman,d.j.,&cragg,g.m.等最新的统计，从1981年到2019年全球上市的小分子药物中超过60％都直接或间接和天然产物有关。尤其是在抗肿瘤药物中，70.8％的药物源于天然产物(journal of natural products2020,83,770-803)。嵌入结合dna的药物如阿霉素，柔红霉素，喜树碱、长春碱类、鬼臼毒素、小檗胺等均来源于天然产物。阿霉素和柔红霉素来源于波塞链霉菌代谢产物。喜树碱和长春碱和鬼臼毒素、小檗胺等来源于植物提取物。从天然提取物中筛选出新的嵌入结合核酸的化合物，可为开发新型的抗肿瘤药物以及其它以核酸为靶点的新药开发提供机会，为现有的药物结构改造提供独特思路，揭示dna结合化合物的构效关系，从而优化现有抗癌药物设计。

3、传统的检测核酸结合化合物的分析方法包括，紫外吸收光谱，荧光光谱法，dna亲和层析法，透析法，凝胶电泳法，表面等离子共振，质谱，核磁等方法。然而这些方法难以直接对含有多种成分的复杂混合溶液中是否存在核酸结合的化合物进行直接检测，往往还需要通过对可溶成分的多步纯化处理(如，萃取、色谱纯化、结晶、树脂吸附、蒸馏处理等)得到细分可溶成分后，再对这些化合物和核酸的相互作用进行检测。由于微生物和动植物的次生物质种类繁多,一定的次生代谢反应仅在特定的物种、器官或组织中于一定的环境和时间条件下才产生，再加上部分次生代谢产物较难在溶剂提取中富集，因此在完成分离纯化之前鉴定微生物和动植物的中是否存在嵌入核酸的化合物非常困难。

4、目前分离纯化天然产物中化合物的主要方法为色谱法，包括吸附柱色谱法，分配色谱法，膜分离法和凝胶色谱法，离子交换色谱等。经过分离纯化后的组分再经过荧光、紫外、质谱等技术确定其中是否含有dna结合的化合物。但是这些方法都依赖于单一化合物的分离，如果存在分析干扰光谱或者质谱信号的化合物则无法分析。而分离纯化的过程需要大量的样品，繁琐的纯化步骤，一些不稳定的化合物可能在纯化过程中反应。因此，开发直接检测复杂的混合物如菌液，动植物提取物等，有助于快速鉴定产生核酸加合物的生物样本，对化合物的分离提供快速精准的指导，能加速新型的核酸结合化合物的发现。

5、单分子操纵技术已经广泛应用于小分子和核酸的相互作用的检测。perkins等在1995年用单个dna分子的拉伸实验观察到dna嵌入剂溴化乙啶嵌入dna引起双链dna长度增加(science,1995,268,83-87)。vladesc等人通过单分子操纵实验测量双链dna的力-拉伸曲线(force-extension curve)，用于定量dna嵌入剂和dna结合的解离常数(naturemethods,2007,4,517-522)。根据biebricher等人的报道(nature communications,2015，6(1),1-12)，每嵌入一个化合物分子会引起dna的轮廓长度增加0.34纳米。我们此前发展了一种用单分子力学操纵的方法检测小分子化合物和dna形成共价结合的嵌入型加合物的方法(cn15166131a)，该方法主要针对纯化后的单一化合物在酶催化下的共价结合核酸的能力进行定量，通过洗去非共价结合的化合物，检测共价结合的嵌入型加合物，并不针对非共价嵌入结合核酸的化合物，更无涉及复杂样品中是否存在非共价结合核酸的核酸嵌入剂的鉴定。

6、值得注意的是，此前的单分子分析主要用于已知的单一化合物与核酸嵌入结合能力的分析(nature methods,2007,4,517-522)。特别是针对简单溶液体系，即背景组分简单的溶液样品的分析和检测。比如化学合成的化合物，以及从天然产物中提取分离出来的单一化合物。目前，对于微生物、植物、动物的提取液，代谢产物，次生代谢物，待检测的自然界土壤样品，自然界水体样品等中是否存在非共价结合核酸的嵌入剂仍然缺乏有效的分析方法。针对复杂溶液系统中的微量核酸嵌入剂，能否在不经过纯化处理分离出单一核酸嵌入剂的情况下，用单分子方法检测仍是具有挑战性的课题。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种分析复杂混合溶液中核酸嵌入剂的方法，首次将单分子操纵技术用于检测成分复杂的混合溶液(可来自于例如：微生物、植物、动物的提取液，代谢产物，次生代谢物；待检测的自然界土壤样品，自然界水体样品)，检测其中是否存在非共价嵌入双链核酸的小分子化合物，这一方法特别适用于天然有机化学领域，尤其可用于微生物核酸结合化合物的生物活性筛选，从微生物、动物和植物中发现新的核酸嵌入化合物。另外，该方法也可以用于药学领域，用于药物分析，即，用于非共价的核酸嵌入药物的药代动力学分析，药理学毒理学分析。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种使用单分子操纵检测分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、(a)准备待测的复杂混合溶液，所述待测的复杂混合溶液来自以下至少一种：微生物培养液，微生物提取液，微生物次生代谢物；动物体液，动植物组织，动植物组织提取液，动植物组织代谢产物；自然界土壤样品，自然界水体样品；

4、(b)将双链核酸分子固定在第一表面和第二表面之间，其中，所述第一表面保持位置不变，所述第二表面为可移动表面；

5、(c)通过力学拉伸双链核酸分子，测量双链核酸分子的长度；

6、(d)向双链核酸分子施加待测的复杂混合溶液，采用与步骤(c)力学拉伸相同的力学条件，通过力学拉伸双链核酸分子，检测双链核酸分子的长度变化，从而基于长度的变化，判断待测的复杂混合溶液中是否存在非共价嵌入结合核酸的化合物；

7、并且，所述方法还满足以下条件中的至少一者：

8、条件一：所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液自身不含酶成分，或者，所述待测的复杂混合溶液通过加热、超声、加入蛋白变性剂、加入酶抑制剂、加入金属离子螯合剂中的至少一种处理使体系中潜在的酶失活；

9、条件二：所述步骤(d)中，自所述施加待测的复杂混合溶液到开始检测双链核酸分子的长度变化，耗时小于10分钟。

10、作为本发明的进一步优选，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液是通过将微生物培养液、微生物提取液、微生物次生代谢物、动物体液、动植物组织提取液、动植物组织代谢产物中的至少一者离心取上清得到的；或者，是通过将动植物组织、土壤中的至少一者溶解分散于液体介质中后取上清得到的；

11、其中，所述动物体液优选为血液、尿液、消化液、组织液中的至少一种。

12、作为本发明的进一步优选，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液未经过纯化处理，是仅经过过滤和/或离心处理去除不可溶成分得到的澄清液体。

13、作为本发明的进一步优选，所述步骤(b)中，所述双链核酸分子选自：双链dna分子，双链rna分子，dna/rna杂合链分子；

14、所述双链核酸分子的长度为100碱基对-100000碱基对范围内；

15、优选的，所述双链核酸分子为双链dna分子。

16、作为本发明的进一步优选，所述步骤(b)中，所述固定是将双链核酸的一条链至少一个碱基直接或间接的附着到第一表面，双链核酸另一条链的至少一个碱基直接或间接的附着到第二表面；

17、或者，所述固定是将双链核酸的一条链至少一个碱基直接或间接的附着到第一表面，该链不同位置的至少一个碱基直接或间接的附着到第二表面。

18、作为本发明的进一步优选，所述步骤(b)中，所述第一表面和第二表面独立的选自玻璃表面、塑料表面、石英表面、石墨烯表面、金属表面、陶瓷表面；

19、并且，所述第二表面为颗粒表面或探针表面；所述颗粒或所述探针的尺寸在10纳米到100微米的范围内；

20、优选的，所述第二表面为超顺磁性颗粒表面。

21、作为本发明的进一步优选，所述步骤(c)中，所述力学拉伸所施加的外力在0.1皮牛顿～100皮牛顿范围内，由永磁体、电磁铁、离心机、声学、超声波、激光束、流体运动、流体浮力或重力施加；

22、优选的，所述力学拉伸是通过单分子磁镊设备施加的；

23、更优选的，所述力学拉伸所施加的外力为1-60皮牛顿。

24、作为本发明的进一步优选，所述步骤(c)和所述步骤(d)中，力学拉伸均是通过施加随时间变化的外力，并记录双链核酸分子随力学参数的长度变化过程。

25、作为本发明的进一步优选，待测的复杂混合溶液中含有唯一一种非共价核酸嵌入剂、且该非共价核酸嵌入剂的种类已知时，所述方法还包括步骤：

26、(e)准备该非共价核酸嵌入剂不同浓度的标准品，将每个标准品替代所述待测的复杂混合溶液，采用与步骤(b)-步骤(d)相同的操作，在同一力学拉伸所施加的外力条件下，测量加入不同浓度梯度下嵌入剂标准品后双链核酸分子的长度变化，作为标准曲线；通过对比标准曲线中长度变化与步骤(d)得到的待测的复杂混合溶液导致的长度变化，定量待测的复杂混合溶液中所含单一非共价核酸嵌入化合物的浓度；

27、优选的，力学拉伸所施加的外力为1-60皮牛顿。

28、按照本发明的另一方面，本发明提供了上述方法在制备药物或筛选药物中的应用，判断复杂混合溶液是否含有非共价核酸嵌入化合物；

29、优选的，待测的复杂混合溶液来自以下任意一者：微生物培养液，微生物提取液，微生物次生代谢物；植物组织，植物组织提取液。

30、按照本发明的又一方面，本发明提供了上述方法在制备药物或筛选药物时对药物药代动力学分析中的应用，其特征在于，待测的复杂混合溶液来自服药后动物的动物体液、动物组织、动物组织提取液和/或动物组织代谢产物。

31、按照本发明的再一方面，本发明提供了上述方法在制备药物或筛选药物时对药物毒理学分析中的应用，其特征在于，待测的复杂混合溶液来自服药后动物的动物体液、动物组织、动物组织提取液和/或动物组织代谢产物。

32、作为本发明的进一步优选，方法还包括步骤：

33、(e)配制不同浓度梯度的非共价核酸嵌入药物溶液标准品，将每个标准品替代所述待测的复杂混合溶液，采用与步骤(b)-步骤(d)相同的操作，在同一力学拉伸所施加的外力条件下，测量加入不同浓度梯度的核酸嵌入药物溶液标准品后双链核酸分子的长度变化，作为标准曲线；

34、通过对比标准曲线中长度变化与步骤(d)得到的待测的复杂混合溶液导致的长度变化，定量待测的复杂混合溶液中所含非共价核酸嵌入药物的浓度。

35、通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明首次报道了用单分子操纵实验直接检测菌液上清，植物提取液以及动物血液样品等混合溶液中是否存在非共价嵌入结合双链核酸的化合物。现有技术无法直接鉴定混合溶液中的dna嵌入剂，需要从数升或者千克的微生物培养发酵后使用大量溶剂对产物进行萃取，以得到活性化合物，再利用不同的色谱技术进行多步分离纯化得到较为纯净的化合物后才能用光谱或者质谱等方法检测。和传统方法相比，本发明具有以下优势：(1)待测样品无需复杂的分离纯化，仅需要简单的过滤和/或离心处理去除不可溶成分即可(以后文实施例2-3等为例，它们仅进行了简单的离心取上清)，无需对可溶成分进行纯化、细分，避免了工序繁琐的多步纯化处理(如，萃取、色谱纯化、结晶、树脂吸附、蒸馏处理等)。(2)所需样品量小，仅需微升样品量。(3)检测灵敏度高；并且，通过在双链核酸两端施加外力(优选为1-60皮牛顿)，能够增强化合物的嵌入结合，进一步提高检测灵敏度。本发明也可以针对具有唯一一种非共价核酸嵌入剂、且该非共价核酸嵌入剂的种类已知时，通过梯度浓度标准品测量浓度。以后文实施例1、5为例，本发明提出了测量加入不同浓度dna嵌入剂标准品后dna伸长量的标准曲线，从而定量混合溶液中该嵌入剂浓度的方法。本发明实施例证实在双链dna受力的情况下检测能把对dna嵌入剂柔红霉素的检测限从微摩尔每升提高到纳摩尔每升。

36、本发明方法既可以对待测的复杂混合溶液进行酶失活处理(如，加热、超声、加入蛋白变性剂、加入酶抑制剂、加入金属离子螯合剂)，又可以通过控制向双链核酸分子施加待测的复杂混合溶液进行检测的时长(时长小于10分钟)，确保双链核酸分子的长度变化是来自非共价嵌入结合核酸的化合物，避免共价嵌入结合的影响(当然，对于未知的待测复杂样品自身不含酶成分的，酶失活处理也可以省略)。

37、本发明适用于对复杂混合溶液进行检测分析，能够分析检测待测样品中是否存在非共价嵌入结合双链dna(或双链rna，或dna/rna杂合链)的小分子化合物。本发明适用于对复杂混合溶液是来自于微生物培养液，微生物提取液，微生物次生代谢物；动物体液，动植物组织，动植物组织提取液，动植物组织代谢产物；自然界土壤样品，自然界水体样品的复杂混合溶液，成分复杂(例如，微生物的次生代谢物为来源于微生物，经过简单水溶、过滤、离心后的样品；动物体液为血液、尿液、唾液、血清以及来源于细胞或组织的液体，经过简单水溶、过滤、离心后的样品；植物组织液为植物组织破碎后，均匀分散至一种或多种液体介质中的混合溶液；也可以检测环境样品，如待检测的土壤，水样品)。

38、以微生物培养液、微生物提取液、微生物次生代谢物为例，由于微生物、动物、植物的组织液，代谢产物，次生代谢物中成分复杂，包括蛋白，核酸，糖，脂质，多种有机和无机的小分子。这些复杂组分往往会对检测造成干扰。传统方法在这些复杂溶液系统中能否检测到能够嵌入结合双链核酸的小分子化合物仍是具有挑战的课题。此外，由于核酸结合化合物本身对细胞核酸代谢的影响，微生物、动物、植物组织液，代谢产物，次生代谢产物中核酸嵌入结合化合物浓度并不高，如何利用单分子操纵实验提高检测的灵敏度，仍有待新的定量方法的开发。本发明首次证实这些复杂组分不会干扰单分子操纵实验中力-拉伸曲线的测量，并且证明能够通过在核酸上施加拉力，增加小分子化合物嵌入双链核酸的结合常数，提高检测微量核酸嵌入剂的检测限(检测限即，能检测到核酸嵌入结合的最低浓度)，从而高效、高灵敏度的检测复杂混合溶液中是否含有核酸嵌入剂(即，能够嵌入核酸的化合物)。

39、基于本发明方法，对于待测样品，可以收集样品并通过前处理使目标分析物溶于水溶液或者均匀分散在液体介质中，得到待检测的混合溶液；例如，当待测样品为来源于动物，植物，微生物，环境样品和化学合成的样品时，前处理方法可以为水溶，稀释，超声，过滤，离心等过程中的一种或者多种操作使目标分析物溶于水溶液或者均匀分散在液体介质中(液体介质优选的为与水互溶的溶剂，如乙醇)，得到例如微生物液体培养液上清，动物血液、尿液、消化液的上清，动植物的提取液及代谢产物，化学合成的化合物溶液上清等，可作为待测的复杂混合溶液。本发明方法只需要简单的溶解前处理，即可对复杂样品中是否含有核酸嵌入剂进行检测分析。例如，当样品为培养液，提取液，体液等液体样品时，样品前处理方式可以为离心取上清；当样品为动植物组织，土壤等固体样品时，前处理方式可以为溶解分散于液体介质中后取上清。

40、本发明利用单分子操纵技术，通过对双链核酸施加外力检测核酸嵌入剂导致的双链核酸长度的增加，并且尤其可通过外力提高了对核酸嵌入化合物的检测灵敏度。本发明可用于微生物生物活性筛选，也可用于核酸嵌入剂类药物的血药浓度和组织药物浓度检测。以后文实施例为例，基于本发明方法，在一个实施例检测了天蓝淡红链霉菌代谢物中的核酸嵌入化合物，在另一个实施例中检测了药用植物何首乌的水提液中的核酸嵌入化合物，以及在一个实施例中检测小鼠注射柔红霉素后体内血浆中的柔红霉素，并可进一步利用标准曲线确定血药浓度的方法。本发明能够应用于新药物研发(如，筛选新药物)，判断待测样品中是否含有核酸嵌入化合物等目标功能成分。例如，本发明方法可以用于从微生物和植物中筛选新型的核酸嵌入化合物，筛选新药物。本发明也适用于对其他中医药材是否含有核酸嵌入化合物进行检测分析，从而对某一中医药材是否值得纯化得到其中的功能成分进行初步评价。

41、本发明利用单分子操纵技术，在单分子力学拉伸实验测量过程中，记录加入待测样品溶液前后双链核酸分子的长度变化，从而用于判断待测样品中化合物嵌入结合核酸的能力。由于溶液离子条件对双链核酸伸长量的影响主要在于对持续长度(persistencelength)的影响。在一定外力存在的情况下，双链核酸的末端到末端距离接近双链核酸的轮廓长度(counter length)。溶液的离子条件不会导致核酸轮廓长度的显著增加(biophysical journal 2019,116,196-204)。多数蛋白结合包裹双链核酸会降低双链核酸的长度或者增加双链核酸的持续长度，但不会导致核酸在受力下长度的增加。因此，在受力下所测得的双链核酸长度增加是核酸嵌入剂独有的特征。

42、以使用双链dna检测微生物代谢物中的核酸嵌入剂为例，本发明在菌的核酸结合蛋白质结合双链dna后对dna的拉伸曲线(force-extension curve)性质的改变包括：(i)蛋白质结合改变dna的持续长度(persistence length),导致小力(小于10皮牛顿)下双链核酸的长度增加或者降低,但是在大力下双链核酸长度却并无显著增加。(ii)蛋白结合双链dna后会弯曲或者缠绕双链dna，如组蛋白等，会导致拉伸下dna的末端到末端长度(end toend distance)变低。这两种变化都显著的不同于小分子核酸嵌入剂对双链dna拉伸曲线的改变。因此，本发明证明能够在不分离核酸嵌入剂单一化合物的情况下，通过对核酸受力下长度分析，直接鉴定复杂混合溶液是否存在核酸嵌入化合物。在利用纯化的化合物测量力-伸长曲线后作为标准曲线后，本发明还可以用于定量血液、组织液中所含化合物的浓度。

43、本发明首次报道了在单分子操纵实验中利用双链核酸分子(如，双链dna等)检测菌液上清，植物提取液以及动物血液样品等混合溶液中嵌入核酸的化合物，通过在单分子拉伸实验中引入成分复杂的混合溶液，不仅可以用于混合溶液中化合物嵌入核酸能力的评价，而且可以对菌液粗提物，植物提取物和血液样品以及后续分离提取得到的单组分产物进行核酸嵌入能力的分析。

44、并且，本发明还发现通过增加外力可以增大核酸嵌入化合物的检测限。以后文实施例1为例，本发明证实在1皮牛顿下只能检测到100纳摩尔每升的柔红霉素，但双链dna两端的外力增加到60皮牛顿后，柔红霉素嵌入结合dna的结合常数增加了几个数量级，从而能检测到溶液中浓度为10纳摩尔每升的柔红霉素。因此，基于本发明，单分子操纵方法能够检测微量溶液(10微升)中纳摩尔数量级的柔红霉素，从而能够应用于包括微量的样本的检测。

45、本发明方法也适用于微生物的菌落，植物的组织，动物的血液不同类型的样品，可以通过水溶、稀释、超声、过滤、离心等操作使包含目标分析物在内的可溶成分溶于水溶液或者均匀分散在液体介质中，去除不可溶成分即可，无需纯化处理(也就是说，无需对可溶成分进行细分)，成功实现了在不分离单一化合物的情况下对多种来源的样品的检测。并且，本发明通过施加1-60皮牛顿的外力，检测限比在溶液中不受力的情况要高几个数量级。如后文实施例2-5所证实的，微生物、植物、以及动物样本中的复杂成分不会造成在1皮牛顿到60皮牛顿之间的双链dna长度的显著增加(长度增加<10％)。在受力下所测得的双链核酸长度增加是核酸嵌入剂独有的特征，这使得本发明方法可以在不分离出单一嵌入剂化合物的情况下，检测复杂样品中是否存在嵌入结合核酸的化合物；此外可通过外力增大核酸嵌入化合物的检测限，使得在复杂的溶液中检测微量的核酸嵌入剂成为了可能。

46、综上，本发明通过单分子方法鉴定复杂溶液中是否存在非共价嵌入结合核酸的小分子化合物。本发明对于微生物、动物、植物的组织液，代谢产物，次生代谢物等具有普适性，可对已知的和未知的嵌入核酸化合物的分析。本发明的实施例证明本发明可以用于微生物，植物，以及动物样本的检测，能够检测任何结合双链核酸并导致双链核酸两端长度增加的化合物。在本发明的实施例中菌液上清，植物水提液中，以及血浆中的复杂成分，都不干扰受力下双链核酸两端的长度。本发明无需分离化合物、不需要特殊标记，适用于基于核酸结合活性的微生物和植物的筛选。本发明和微流控等方法结合也适用于对核酸结合化合物的高通量筛选，对于开发新的结合核酸的天然产物，发掘新的抗癌活性分子有重要的意义。在药理毒理研究领域，本发明也可用于纯化后的单一的核酸嵌入结合药物在动物体内药物浓度的分析。