一种基于毛细管电泳技术测定适配体与小分子靶标间相互作用的方法

本发明属于生物分析检测，具体涉及一种基于毛细管电泳技术测定适配体与小分子靶标间相互作用的方法。

背景技术：

1、由于对靶标的高结合亲和力和特异性，核酸适配体已成为一种强大的生物识别元件，可用于药物靶向递送、生物传感和新药开发等领域。适配体能够识别小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标。然而，能够广泛应用的以小分子为靶标的适配体数量很少，多数适配体的特异性识别机理尚不清楚。

2、目前，对于适配体与小分子靶标相互作用的研究，已经开发了荧光适配体传感器用于适配体与小分子靶标的亲和力测定，但是强抑制作用导致该方法检测限相对较高，且反应时间较长(z.j guo,j tian,c.b cui,et al.alabel-free aptasensor for turn-onfluorescent detection of ochratoxin a basedon sybr gold and single walledcarbon nanohorns.food control,2021,123:107741.)。还有人(g.h xu,j.jzhao,h yu,etal.structural insights into the mechanism of high-affinity binding ofochratoxin a by a dnaaptamer.journal of the american chemical society,2022,144(17):7731-7740.)利用nmr技术结合理论模拟的方法研究分子识别机制，但在解析过程中会受到复合物大小、样品量、样品异质性以及结构柔性等不同因素的限制，导致部分信息缺失。

3、毛细管电泳技术作为一种快速的分离分析技术，具有样品用量少、分析速度快、分离模式多样等特点，不仅可用于对核酸、蛋白质这类生物分子的定性定量分析，而且通过不同的分离模式可用于研究分子间的相互作用。其中，前沿分析毛细管电泳法是在毛细管中注入一段相对较多的预平衡混合物(200-300nl)，通过测定未结合的客体平台信号峰的峰高来确定二者间的结合常数和结合计量关系。适配体与小分子靶标发生结合相互作用时，通常包含特异性结合和非特异性结合，在较低小分子浓度时，主要以特异性结合为主，随着小分子浓度的增大，非特异性结合增大，平均结合计量比不断增大，现有的毛细管电泳法建立的公式未对非特异性结合进行扣除，获得的结果准确度不高。在以正向电压进行的毛细管电泳分析中，由于溶液中带负电荷的小分子表观迁移率较小，常导致出峰时间长，峰形不对称等问题。对于中等强度的分子间相互作用，选择合适的适配体/小分子摩尔比例十分重要。若适配体/小分子摩尔比过小，则平台峰高的变化不明显；若适配体/小分子摩尔比过大，则平台峰高下降幅度过大，结果的准确度下降。因此，有必要发明一种准确高效的方法来对适配体与小分子靶标的作用机制进行分析研究。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种基于毛细管电泳技术测定适配体与小分子靶标间相互作用的方法，能有效解决现有方法检测限较高，反应时间较长，解析时部分信息缺失，结果不准确等不足之处。

2、技术方案：一种基于毛细管电泳技术测定适配体与小分子靶标间相互作用的方法，包括以下步骤：

3、(1)适配体水溶液的配制：将适配体溶解于水中，涡旋振荡后离心脱盐，通过微量紫外分光光度计对适配体水溶液进行定浓，得到适配体储备液，于4℃冷藏保存；

4、(2)小分子靶标储备液的配制：将小分子靶标溶于甲醇中，涡旋振荡，得到小分子靶标储备液，将小分子靶标储备液于棕色瓶中-20℃冷冻保存；

5、(3)电泳缓冲液的配制：将醋酸铵溶于去离子水中，用50％醋酸调节溶液ph，用0.22μm微孔滤膜过滤脱气，得到nh4oac电泳缓冲液；

6、(4)羟丙基纤维素中性涂层毛细管的制备：将内径50μm的裸熔融石英毛细管依次用ch3oh、h2o、0.1mol/l naoh、h2o、0.1mol/l hcl、h2o和空气在40psi压力下分别冲洗30min，之后在50psi下用羟丙基纤维素溶液冲洗60min，在40psi下用空气冲60min，得到改性后的毛细管在气相色谱中进行烘烤，最后得到羟丙基纤维素涂层毛细管；

7、(5)标准曲线的绘制：将小分子靶标储备液按照不同比例加入到电泳缓冲液中混合均匀，得到一系列不同浓度的小分子靶标样品溶液，分别进行毛细管电泳前沿分析，通过确定平台信号峰的峰高与相应小分子靶标样品溶液的浓度间的关系，绘制出标准曲线；

8、(6)对适配体与小分子靶标混合溶液进行毛细管电泳前沿分析：将小分子靶标储备液和适配体储备液按照不同比例加入到电泳缓冲液中混合均匀，得到一系列含不同浓度小分子靶标和适配体混合的预平衡样品溶液，静置30min后，在步骤(5)条件下进行毛细管电泳前沿分析，获得相应的face流出曲线；

9、(7)结合常数的确定：根据步骤(6)得到的face流出曲线，确定相应的小分子靶标平台峰的峰高，根据标准曲线计算确定游离的小分子靶标浓度cf，将小分子靶标的总浓度减去游离的浓度求出已结合的小分子靶标浓度cb，根据下式(1)确定平均结合计量比i：

10、

11、其中，ht为适配体的总浓度；再根据下式(2)对i-cf进行非线性拟合得到结合曲线，来确定结合常数k和结合位点数n的关系：

12、

13、(8)特异性结合的结合常数确定：因主客体结合通常是特异性结合与非特异性结合共存，当小分子靶标浓度较低时，其与适配体间相互作用以特异性结合为主；当小分子靶标浓度较高时，特异性结合位点趋于饱和，其与适配体间相互作用以非特异性结合为主，且结合曲线呈线性趋势；通过对浓度为280-400μmol/l的小分子靶标进行线性拟合，由斜率得到非特异性结合因子λ，则特异性结合的平均结合计量比i’可根据下式(3)得到：

14、i’＝i-λcf            (3)，

15、最后，将i’代替式(2)中的i，对i-cf进行非线性拟合得到结合曲线，来确定特异性结合的结合常数k’和结合位点数n’。

16、优选的，所述适配体的核苷酸序列如seq id no:1所示，

17、seq id no:1：ggggtgaaacgggtcccg。

18、优选的，所述小分子靶标为赭曲霉素。

19、优选的，所述nh4oac电泳缓冲液的ph为5.8-7.8，浓度为10-30mmol/l。

20、优选的，所述毛细管电泳前沿分析选用羟丙基纤维素中性涂层的毛细管，进样参数：压力进样1psi 90s；分离参数：分离电压为-20kv，辅助压力为0.3psi；检测波长为：225nm；每次进样前，使用电泳缓冲液在10psi下冲洗3min。

21、优选的，所述预平衡样品溶液中小分子靶标的终浓度为80-400μmol/l，适配体的终浓度为20μmol/l。

22、有益效果：1)通过本发明建立的方法，高浓度范围游离小分子浓度对结合计量比进行线性拟合，得到非特异性结合因子，通过构建的公式从平均结合计量比中扣除非特异性结合的部分，再进行非线性拟合可确定特异性结合的结合常数和结合计量比，提高了分析结果的准确性，该方法也可延伸用于其它核酸与小分子相互作用等体系的亲合力分析；

23、2)本发明建立的毛细管电泳前沿分析法，使用羟丙基纤维素(hpc)中性涂层毛细管，采用反向电压结合压力辅助进行电泳分离，可显著缩短分析时间，并改善平台峰的峰形，提高了结果的准确度；

24、3)在本发明选择的适配体/小分子摩尔比范围下，获得的结合曲线与公式相匹配，结果的准确度高。