一种基于机器学习的拉曼标记免疫层析试纸的制备及其检测方法与流程

本发明属于生物检测，更具体地说，本发明涉及一种基于机器学习的拉曼标记免疫层析试纸的制备及其检测方法。

背景技术：

1、呼吸道病毒是威胁人类生命健康的主要杀手。目前，市面上传统的呼吸道病毒检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应核酸检测(rt-pcr)和胶体金法抗原试纸检测两种。逆转录聚合酶链式反应核酸检测检测时间长、操作复杂并且实验室要求高，不适用于现场快速检测。胶体金法抗原试纸检测具有快速、便捷的特点，能够实现居家自检，但其通过肉眼观察显色来判定结果，检测灵敏度较低，并且呼吸道病毒感染患者感染初期由于病毒载量较低可能导致无法检出的情况。

2、表面增强拉曼光谱技术(surface enhanced raman spectroscopy,sers)因为其具有灵敏度高、操作简单和检测时间短等特点，在生物领域广泛应用。拉曼标记免疫层析技术是一种引入染料分子等小分子作为标记物，通过特异性免疫反应实现呼吸道病毒-标记物的富集，测试标记物的拉曼光谱，间接实现病毒的检测，但该检测方法在低载量呼吸道病毒检测时由于拉曼探针无法有效富集产生拉曼“热点”区域而造成灵敏度降低，同时也存在谱图信号弱，肉眼难以辨别等问题。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

2、为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于机器学习的拉曼标记免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、制备“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针；

4、s2、使用制备的“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针，制备拉曼探针偶联抗体；

5、s3、使用偶联抗体后的拉曼探针溶液，制备得到拉曼标记抗原检测试纸。

6、优选的是，其中，所述s1的具体方法包括：

7、s11、在金纳米颗粒溶液中加入适量染料分子溶液，混合均匀，使染料分子吸附在金纳米颗粒表面；

8、s12、再加入适量巯基聚乙二醇羧基剧烈振荡1～2h，3000～12000rpm转速离心,弃上清液后超纯水重悬至原始体积；

9、s13、将一定体积s12的溶液加入至适量氨水溶液中，再加入适量硅酸四乙酯溶液反应，在染料分子外部形成sio2包被，3000～12000rpm转速离心20min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积；

10、s14、然后再加入适量聚乙烯亚胺溶液，超声处理10～30min，3000～12000rpm转速离心10～20min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积，重复离心两次；聚乙烯亚胺溶液的作用是为了使小尺寸金纳米颗粒能够吸附在金纳米颗粒、染料分子和sio2包被复合的表面；

11、s14、然后再加入适量聚乙烯亚胺溶液，超声处理10～30min，3000～12000rpm转速离心5～10min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积，重复离心两次；

12、s15、加入一定体积的小尺寸金纳米颗粒，超声处理10～30min，使小尺寸金纳米颗粒吸附在sio2表面，然后3000～12000rpm转速离心10～30min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积，重复离心两次，除掉多余的小尺寸金纳米颗粒；

13、s16、加入一定体积的聚乙烯吡咯烷酮，超声处理5～20min，然后3000～12000rpm转速离心10～30min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积，重复离心两次；

14、s17、加入适量盐酸羟胺溶液后超声混匀5～20min，再加入适量氯金酸溶液，超声混匀5～20min，使其在小尺寸金纳米颗粒表面包被一层金膜，最后8000rpm转速离心10～30min，弃上清液后超纯水重悬至原始体积，重复离心两次，除去溶液中的多余试剂，最终制备得到“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针。

15、优选的是，其中，所述s11中，金纳米颗粒溶液的浓度为万分之四，所述染料分子为浓度1mm的4-氨基苯酚或0.1mm的异硫氰基孔雀石绿；

16、所述s12中，巯基聚乙二醇羧基的浓度为0.1mm；金纳米颗粒溶液、4-氨基苯酚、巯基聚乙二醇羧基的体积比为1ml:3μl:200μl，金纳米颗粒溶液、异硫氰基孔雀石绿、巯基聚乙二醇羧基的体积比为1ml:4μl:200μl；

17、所述s13中氨水溶液为乙醇稀释至质量分数为0.2～0.3％，硅酸四乙酯的质量分数为1％，s12重悬后的溶液与氨水、硅酸四乙酯的体积比为0.5～3ml:2～10ml:20～30μl；

18、所述s14中，聚乙烯亚胺的浓度为5～20mg/l；

19、所述s15中，小尺寸金纳米颗粒的粒径为5nm～10nm，质量分数为万分之四；

20、所述s16中，聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000，质量分数为1％；

21、所述s17中盐酸羟胺溶液的浓度为10mm，氯金酸溶液的浓度为5mm；

22、所述s14、s15、s16和s17中，聚乙烯亚胺溶液、小尺寸金纳米颗粒溶液、聚乙烯吡咯烷酮、盐酸羟胺溶液、氯金酸溶液与s13中氨水的体积比为0.5～2ml:0.5～2ml:200～600μl:20～60μl:20～60μl:2～10ml。

23、优选的是，其中，所述s2的具体方法包括：

24、s21、向s1得到的“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针溶液中加入适量(3－巯基丙基)三甲氧基硅烷溶液，振荡反应1～2h，3000～12000rpm转速离心，弃上清液后超纯水重悬至原始体积；

25、s22、再加入适量4－(n－马来酰亚胺甲基)环己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液和呼吸道病毒靶标蛋白标记抗体，摇匀反应；

26、s23、再加入适量牛血清蛋白或酪蛋白溶液，封闭反应，然后再离心，弃上清后使用复溶液重悬，得到拉曼探针偶联抗体。

27、优选的是，其中，所述s2中，(3－巯基丙基)三甲氧基硅烷溶液的浓度为20～60mm，4－(n－马来酰亚胺甲基)环己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为2～6μm，牛血清蛋白或酪蛋白溶液的质量分数为10～30％；“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针溶液、(3－巯基丙基)三甲氧基硅烷、4－(n－马来酰亚胺甲基)环己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液、牛血清蛋白或酪蛋白溶液的体积比为0.5～2ml:1～3μl:1～3μl:5～15μl。。

28、优选的是，其中，所述s3的具体方法包括：

29、s31、将样品垫处理液按照1ml:18cm2的比例处理玻璃纤维膜，42℃干燥处理12h后获得样品垫；所述样品垫处理液成分为质量分数0.002％的吐温20、50mm浓度ph＝7.4的磷酸溶液和质量分数20％的阻断剂；其中吐温20、磷酸溶液、阻断剂的质量分数比为0.002％：0.005％：20％，阻断剂为菲鹏生物阻断剂hier-r-015或hier-r-016；

30、s32、将偶联抗体后的“aunp-染料分子@sio2@aunp@au”拉曼探针溶液按照1ml:18cm2比例添加至玻璃纤维膜上，使用烘箱40～45℃干燥处理5～12h获得结合垫；

31、s33、将1.5mg/ml呼吸道病毒靶标蛋白的单克隆包被抗体、1.5mg/ml多克隆抗体使用划膜喷金仪按照0.5～2μl/cm的用量分别划膜至硝酸纤维素膜的t线与c线位置，40～45℃干燥处理5h～12h；

32、s34、最后，将处理好的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫重叠搭接依次粘贴固定在pvc板上，使用斩切机裁切成条，装入卡壳。

33、一种基于机器学习的拉曼标记免疫层析试纸的检测方法，包括以下步骤：

34、s4、使用s3制备的拉曼标记抗原检测试纸获得采集的咽鼻拭子样本的拉曼光谱；

35、s5、设计基于机器学习的数据分析算法，对采集的咽鼻拭子样本的拉曼光谱进行分析判别。

36、优选的是，其中，所述s4的具体方法包括：

37、将采集的咽鼻拭子样本浸入600～1000μl样本提取液中，等待1～5分钟，得到样本混合液，然后将100～120μl样本混合液滴加至拉曼标记抗原检测试纸的样品垫上，等待5～20min，拉曼标记抗原检测试纸层析过程完成，然后使用移动式拉曼光谱仪的785nm激光对拉曼标记抗原检测试纸的t线进行拉曼光谱测试；测量前使用si样品进行波数校准；采用50×物镜长焦镜头采集拉曼信号；采用快速拉曼面扫模式采集数据，单点积分时间为0.5～2s，激光功率为5～20mw；考虑到试纸的t线上拉曼探针分布的不均匀性，每个试纸t线上随机选择两个面扫区域，每个区域范围为200μm×50μm，采集20×5个离散点图，点间距为5～20μm，以覆盖足够大的测试面积，两个面扫结果取平均值；选择的光谱范围为600cm-1～1680cm-1，该波段包含了拉曼探针的大部分指纹信息。

38、优选的是，其中，所述s5的具体方法包括：设计的基于机器学习的数据分析算法对拉曼光谱的数据分析包括预处理和神经网络模型判别两个步骤；

39、其中，预处理包括宇宙线缪子噪声扣除、卷积滤波、基线校正和归一化算法；

40、神经网络模型为全连接网络，包括输入层、输出层和三个隐藏层，三个隐藏层的神经元数目分别为521、256和32；

41、数据分析算法接收单个拉曼光谱数据，经过宇宙线缪子噪声扣除、卷积滤波、基线校正和归一化算法进行预处理，将预处理的拉曼光谱输入至神经网络模型，神经网络模型输出二分类衡量指标，并通过欧式距离判别光谱为阴性或阳性，即神经网络模型的输出与(0,1)和(1,0)的欧式距离，距(1,0)更近为阳性，距(0,1)更近为阴性；其中，用于神经网络训练的阴性数据集通过实验不含拉曼探针的样品获得，由于实验中拉曼探针分布具有随机性，无法保证阳性样品所测得光谱一定包含拉曼探针信号，阳性光谱数据集通过人工判断获得的若干阳性光谱与阴性光谱叠加获得，考虑到拉曼探针除本身存在的“热点”区域外，富集后也会形成“热点”区域，因此“热点”区域的形成具有较强的随机性，会导致探针拉曼峰的强度相对噪声波动大，在阳性光谱与阴性光谱叠加前，会以0.1-1的比例随机调制其幅度并添加随机噪声，以使阳性光谱数据集具有更高的完备性。

42、优选的是，其中，设计基于机器学习的数据分析算法，对采集的咽鼻拭子样本的拉曼光谱进行分析判别的具体方法包括：

43、s51、宇宙线缪子噪声扣除算法：具体设计了一种基于双窗基线判定的扣除算法，实现了有效的宇宙线缪子噪声抑制；实现方式如下：

44、s511、设计了两个中心对齐的判定窗和基线窗，判定窗宽度为20个点，对应典型缪子噪声展宽的最大值；基线窗宽度为42个点，在该宽度内基线认为保持稳定，且该宽度小于大多数特征谱线宽度，以避免强特征谱线被误识别为宇宙线噪声；

45、s512、分别计算判定窗之外、基线窗之内的基线的均值和标准差；

46、s513、设置判定阈值为20倍标准差，若判定窗中心点强度超过基线均值20倍标准差，则认定该点为宇宙线噪声点，令该点数值等于基线均值；

47、s514、判定窗和基线窗沿光谱平移，重复s512-s513，完成整个光谱的宇宙线噪声扣除；

48、s52、卷积滤波算法，具体实现方式为：假设原拉曼光谱数据为x，共m个数据点；滑动窗口大小为w，w通常是一个奇数，w表示光谱中连续的w＝2n+1个点；现对窗口内的光谱数据做多项式拟合，假设多项式具有如下形式：

49、

50、其中j＝-n,-n+1,...,-1,0,1,n-1,n，j表示窗口中心点i左右的2n+1个点，i＝1,2,...,m，ak为多项式系数，k为多项式最高次数；这是一个用2n+1个方程求解k+1个系数的问题，必须满足w＝2n+1≥k+1；将上式表示为矩阵形式，即：

51、x(i)＝ja

52、其中

53、

54、利用最小二乘法对此方程组进行求解，得到a的估计值：

55、

56、将代回方程组中即可解出x(i)的估计值

57、中居中心的一项的即为此滑动窗口对中心点i处的数据xi的s-g卷积平滑的结果；不难看出，即为j＝0时的拟合多项式值：

58、

59、令v＝(jtj)-1jt，假设其具有如下形式:

60、

61、则等式可改写为:

62、

63、对比可得

64、

65、进而将上式改写为卷积的形式:

66、

67、由此可知，卷积滤波的卷积系数v与光谱数据无关，只与滑动窗口大小为w和多项式拟合的最高次数k有关；当w与k已知后，矩阵j即可写出，因此也可以很快求出v，制定一系列卷积系数，当k＝3，w＝5时，点数j＝-2,-1,0,1,2，依次对应的卷积系数分别为-3,12,17,12,-3，归一化因子norm＝35；当k＝3，w＝13时，j＝-6,-5,-4,-3,-2,-1,0,1,2,3,4,5,6，依次对应的卷积系数分别为-11,0,9,16,21,24,2524,21,16,9,0,-11，归一化因子norm＝143；

68、其中归一化因子norm为各点卷积系数之和norm，基于该卷积系数表和推导得到的卷积公式，即可实现对信号的平滑滤波；

69、s53、基线校正算法，具体实现过程为：根据自然对数运算在处理高计数谱峰方面具有优势，而平方根运算对增强弱峰比较优越的特点，首先使用lls算符对能谱每道计数进行变换：

70、

71、其中i为道址，y(i)为该道址的计数；

72、对于变换后的计数v(i)，需要采用迭代的方式逐步计算向量v1(i)，v2(i)，直到vm(i)进行替换，其中m是给定的自由参数，即迭代次数，决定了滤波窗宽w＝2m+1；在第p次迭代中道址i的新值vp(i)通过比较vp-1(i+p)，vp-1(i-p)的平均值和vp-1(i)得到，其中1≤p＜m，取二者的最小值，即：

73、

74、其中的基本思想是将当前道址i的计数v(i)与滤波窗两端道址(i±m)的计数均值进行比较，较小的即为滤波后的结果，代表该道址处的基线水平；

75、在计算完向量vm(i)后，需要应用逆lls算符来获得最终的基线谱：

76、b(i)＝(exp(exp(v(i)-1)-1))2-1

77、于是扣除基线后的净计数能谱为：

78、n(i)＝y(i)-b(i)

79、可以看到，在进行能谱本底扣除时，迭代次数m是一个非常重要的参数，其取值是否合理直接影响到基线的形状和扣除后的谱形；

80、s54、归一化算法：具体采用最大最小值归一化，假设原拉曼光谱数据为x，其中最大值和最小值分别为xmax和xmin，则归一化光谱为：

81、

82、s55、神经网络模型：具体设计了一种全连接网络，包括输入层、输出层和三个隐藏层，三个隐藏层的神经元数目分别为521、256和32；计算过程如下：令矩阵xn×d表示含有n条光谱的样本，其中每条光谱具有d个特征，d个特征对应于波数点数的强度值；用矩阵hn×h表示一个隐藏层的输出，其中h为隐藏层所含神经元数目；因为各层之间是全连接的，所以有隐藏层权重和隐藏层偏置以及输出层权重和输出层偏置这样，神经网络模型的输出on×2可以这样计算得到：

83、h(1)＝σ1(xw(1)+b(1))

84、h(2)＝σ2(h(1)w(2)+b(2))

85、h(3)＝σ3(h(2)w(3)+b(3))

86、o＝h(3)w(4)+b(4)

87、其中，σ1,σ2,σ3分别是对每个隐藏层应用的非线性激活函数，本模型中采用relu函数形式：

88、relu(x)＝max(x,0)

89、即将归一化的光谱数据x′输入至神经网络模型中，判断输出on×2距(1,0)更近为阳性，距(0,1)更近为阴性。

90、本发明至少包括以下有益效果：本发明提出一种基于机器学习和拉曼标记免疫层析技术的呼吸道病毒检测方法，专利中创新性的提出aunp-染料分子@sio2@aunp@au复合结构拉曼探针，其内核为金纳米颗粒，在金纳米颗粒的表面再附着一层染料分子，在染料分子的外面包被一层二氧化硅膜，在二氧化硅膜的表面附着一层相对内核略小的金纳米颗粒，然后在最外层再包被一层金膜。该探针通过调控sio2层的厚度，使内核的金纳米颗粒与外层的小尺寸金纳米颗粒之间产生拉曼增强“热点”区域，染料分子在“热点”区域内拉曼信号被有效增强，从而实现了探针的单分子检测；探针最外层采用金膜包被，使探针在富集后探针之间能够产生有效的“热点”区域，进一步增强了染料分子的拉曼信号，该探针区别于传统的拉曼探针需要多个探针富集后才能产生拉曼增强“热点”区域，而自身就存在拉曼增强“热点”区域，能够实现拉曼探针的单分子检测，从而实现单个抗原的检测，有效提高了检测灵敏度；另外本发明通过机器学习的数据分析算法，实现了试纸拉曼检测产生的大量谱图的快速分析判别，相对人工判读大大提高了检测效率。

91、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。