分离并检测利奈唑胺起始物料M1及其相关杂质的方法与流程

本发明属于化学分析，具体涉及一种分离并检测利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的方法。

背景技术：

1、利奈唑胺，别名细菌蛋白质合成抑制剂，是一种人工合成的唑烷酮类抗生素，临床上主要治疗革兰阳性球菌引起的感染。利奈唑胺作用于细菌50s核糖体亚单位。与其它药物不同，利奈唑胺不影响肽基转移酶活性，只是作用于翻译系统的起始阶段，抑制mrna与核糖体连接，阻止70s起始复合物的形成，从而抑制了细菌蛋白质的合成。

2、利奈唑胺起始物料m1为苯基类小分子结构，并含有硝基苯警示结构，其分子式为c6h3f2no2，分子量为159.09，结构式如式ⅰ所示。现有技术中多以3,4-二氟硝基苯(自主命名为利奈唑胺起始物料m1)为起始物料来合成利奈唑胺，例如cn102267955a专利将3，4-二氟硝基苯经过反应生成3-氟-4-吗啡啉硝基苯，然后加入少量的催化剂pd/c，在通氢的情况下得到3-氟-4-吗啡啉苯胺，其不经过硅胶柱分离提纯，经过反应生成n-cbz-3-氟-4-吗啡啉苯胺，之后与中间体3-氯-2-乙酰氧基乙酰丙胺反应生成利奈唑胺。

3、

4、研究发现，利奈唑胺起始物料m1在合成过程中可能引入的杂质有m1a、m1b、m1c、m1d、m1e和m1f，其中m1a、m1b、m1c和m1f均含有硝基苯警示结构。现有方法中多采用气相色谱直接进样的方式进行检测，难以满足利奈唑胺对警示结构杂质的灵敏度要求。因此，有必要对建立新的方法对利奈唑胺起始物料m1中有关杂质进行检测和控制，这对提升后续利奈唑胺产品的质量具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用高效液相色谱法分离利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的方法，该方法专属性强、灵敏度高、耐用性好，可以为后续利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的定性鉴别和含量检测提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、利用高效液相色谱法分离利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的方法，所述相关杂质包括杂质m1a、杂质m1b、杂质m1c、杂质m1d、杂质m1e和杂质m1f中的任一种或多种；所述高效液相色谱法中，色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为水，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质m1b、杂质m1c、杂质m1a、利奈唑胺起始物料m1、杂质m1f、杂质m1e和/或杂质m1d进行洗脱分离；

4、所述利奈唑胺起始物料m1的结构式如式ⅰ所示，所述杂质m1a的结构式如式ⅱ所示，所述杂质m1b的结构式如式ⅲ所示，所述杂质m1c的结构式如式ⅳ所示，所述杂质m1d的结构式如式ⅴ所示，所述杂质m1e的结构式如式ⅵ所示，所述杂质m1f的结构式如式ⅶ所示；

5、

6、可以根据洗脱顺序对各组分进行定性。

7、进一步，所述梯度洗脱的程序为：

8、在0分钟，设置流动相a的体积分数为69-71％，流动相b的体积分数为31-29％；

9、在5分钟，设置流动相a的体积分数为69-71％，流动相b的体积分数为31-29％；

10、在12分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

11、在25分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

12、在27分钟，设置流动相a的体积分数为69-71％，流动相b的体积分数为31-29％；

13、在32分钟，设置流动相a的体积分数为69-71％，流动相b的体积分数为31-29％。

14、作为优选，所述梯度洗脱的程序为：

15、在0分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

16、在5分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

17、在12分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

18、在25分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

19、在27分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

20、在32分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％。

21、进一步，所述流动相的流速为0.95ml/min-1.05ml/min，优选为1.0ml/min；色谱柱柱箱温度为24℃-26℃，优选为25℃。

22、作为优选，色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm。

23、作为优选，进样体积为20μl。

24、本发明的目的之二在于提供一种鉴定利奈唑胺起始物料m1中是否含有相关杂质的方法，该方法可以对利奈唑胺起始物料m1中各组分进行定性，且方法灵敏度强，检测限低。

25、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

26、鉴定利奈唑胺起始物料m1中是否含有相关杂质的方法，采用前述分离方法将利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质进行分离；分离后，采用检测波长为250nm的检测器进行检测。

27、进一步，根据检测品与对照品色谱行为的一致性来判断利奈唑胺起始物料m1中是否含有所述相关杂质。

28、进一步，各组分保留时间由短到长依次为：杂质m1b、杂质m1c、杂质m1a、利奈唑胺起始物料m1、杂质m1f、杂质m1e和/或杂质m1d。

29、可以根据保留时间长短对各组分进行定性。

30、作为优选的技术方案，色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm；采用水作为流动相a，甲醇作为流动相b；流动相流速为1.0ml/min，色谱柱柱箱温度为25℃；检测波长为250nm；按照如下梯度洗脱程序进行分离，并得到色谱图；

31、在0分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

32、在5分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

33、在12分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

34、在25分钟，设置流动相a的体积分数为35％，流动相b的体积分数为65％；

35、在27分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；

36、在32分钟，设置流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％。

37、作为优选，保留时间为16.0±0.5min，判定为杂质m1b；保留时间为16.6±0.5min，判定为杂质m1c；保留时间为17.2±0.5min，判定为杂质m1a；保留时间为17.8±0.5min，判定为利奈唑胺起始物料m1；保留时间为18.5±0.5min，判定为杂质m1f；保留时间为19.2±0.5min，判定为杂质m1e；保留时间为19.6±0.5min，判定为杂质m1d。

38、本发明的目的之三在于提供一种利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的含量测定方法，该方法可在32分钟内或大于32分钟的时间实现利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的分离和检测。

39、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

40、利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的含量测定方法，包括如下步骤：

41、(1)分离：利用前述分离方法分离利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质；

42、(2)检测：利用前述鉴定方法对利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质进行检测，并获得色谱图；

43、(3)含量计算：根据步骤(2)测得的色谱图，利用峰面积，按乘校正因子的自身对照法和/或外标法计算各杂质含量。

44、进一步，样品配制溶剂为乙腈水溶液，其中，乙腈和水的体积比为50：50。

45、作为优选，具体检测方法如下：

46、1.配制供试品溶液/样品溶液：取本品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成浓度约为2mg/ml的溶液，摇匀。

47、2.配制对照溶液：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

48、3.检测

49、方法1)：精密量取样品溶液20μl，注入液相色谱仪，按照前述色谱条件进行检测，并记录色谱图；按照乘校正因子的自身对照法计算各杂质含量。

50、校正因子法计算公式如下：

51、

52、式中：ar—供试品溶液中各已知杂质的峰面积；

53、as—自身对照溶液中主峰的峰面积；

54、f—各杂质校正因子。

55、或方法2)：精密量取样品溶液、对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按照前述色谱条件进行检测，并记录色谱图；按照杂质外标法计算各杂质含量。

56、外标法计算公式如下：

57、

58、式中：cs——对照品溶液的浓度，μg/ml；

59、as——对照品溶液中主峰峰面积；

60、ar——供试品溶液中主峰峰面积；

61、cr——供试品溶液的浓度，μg/ml；

62、ps——对照品的含量。

63、进一步，所述杂质m1a、所述杂质m1b、所述杂质m1c、所述杂质m1f的校正因子依次为1.0、0.80、1.0、1.7。

64、进一步，所述杂质m1b的定量限浓度为0.035μg/ml，检测限浓度为0.011μg/ml；所述杂质m1c的定量限浓度为0.046g/ml，检测限浓度为0.014μg/ml；所述杂质m1a的定量限浓度为0.046g/ml，检测限浓度为0.014μg/ml；所述利奈唑胺起始物料m1的定量限浓度为0.067g/ml，检测限浓度为0.020μg/ml；所述杂质m1f的定量限浓度为0.090g/ml，检测限浓度为0.027μg/ml；所述杂质m1e的定量限浓度为0.533g/ml，检测限浓度为0.160μg/ml；所述杂质m1d的定量限浓度为0.746g/ml，检测限浓度为0.224μg/ml。

65、本发明的有益效果在于：

66、本方法自建高效液相色谱法，采用常规的c18色谱柱，甲醇水作为流动相进行梯度洗脱，不仅可有效分离主成分与以上相关杂质，还能满足利奈唑胺对警示结构杂质的灵敏度要求(利奈唑胺起始物料m1及杂质m1a、m1b、m1c和m1f的lod均≤0.0012％)。本方法灵敏度高，专属性好，检测限/定量限低，方法简单、快速，可在32分钟内实现利奈唑胺起始物料m1及其相关杂质的分离和检测。