一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法

本发明属于分析化学，涉及一种原料药中对甲苯磺酸酯类基因毒杂质的检测方法。

背景技术：

1、对甲苯磺酸酯是常见的一类基因毒杂质。研究表明磺酸酯具有诱变性，能够直接或者经代谢活化后间接地将自身结构上的烷基残基转移到富电子的dna碱基上而引起dna的烷基化，从而导致遗传物质的损伤。

2、该类杂质具有以下分析难点：1、限度达ppm级，对方法的灵敏度与选择性要求高。2、属于痕量杂质，存在高浓度api干扰。3、磺酸酯在高水相溶剂中的不稳定性。现有文献报道的方法大多使用lc-ms/ms法，但上述方法存在几个干扰因素：1、质谱是离子化检测的，重复性不好，一般定量需要加内标；2、质谱离子源容易有残留离子或被污染。3，质谱离子峰受参数影响较大。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种原料药中对甲苯磺酸酯类基因毒杂质的检测方法，本发明提供的检测方法检测时，干扰因素少，重现性好。

2、为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法，包括以下步骤：

4、将待测液依次进行一维液相分离和二维液相分离，得到对甲苯磺酸酯类杂质的色谱图；所述对甲苯磺酸酯类杂质包括对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯中的一种或几种；

5、根据所述对甲苯磺酸酯类杂质的色谱图与预定的标准曲线，得到对甲苯磺酸酯类杂质的含量；所述预定的标准曲线为对甲苯磺酸酯类杂质的浓度和峰面积的线性关系；

6、所述一维液相分离的条件包括：进样方式为分段进样；富集柱为c8柱；一维流动相a为磷酸溶液；一维流动相b为乙腈；

7、一维梯度洗脱的程序为：

8、0~5min：所述流动相a的体积百分含量由80%匀速减少到20%；

9、5~12min：所述流动相a的体积百分含量为20%；

10、12~12.5min：所述流动相a的体积百分含量由20%匀速增加到80%；

11、12.5~20min：所述流动相a的体积百分含量为80%；

12、所述二维液相分离的色谱条件包括：色谱柱为五氟苯基色谱柱；柱温：30℃；二维流动相a为水；二维流动相b为乙腈；流速为1ml/min;

13、二维梯度洗脱的程序为：

14、0~7.5min：所述流动相a的体积百分含量为80%；

15、7.5~8.5min：所述流动相a的体积百分含量由80%匀速减少到40%；

16、8.5~12min：所述流动相a的体积百分含量为40%；

17、12~12.5min：所述流动相a的体积百分含量由40%匀速减少到20%；

18、12.5~14min：所述流动相a的体积百分含量为20%；

19、14~14.5min：所述流动相a的体积百分含量由20%匀速减少到5%；

20、14.5~18min：所述流动相a的体积百分含量为5%；

21、18~19min：所述流动相a的体积百分含量由5%匀速增加到80%。

22、19~20min：所述流动相a的体积百分含量为80%；

23、检测条件为：检测器为2个二极管阵列检测器；波长为225nm。

24、优选地，所述富集柱为capcell pak c8。

25、优选地，所述色谱柱为welch ultimate pfp色谱柱。

26、优选地，所述分段进样为进样4个循环至定量环；每个循环为依次进样25μl对甲苯磺酸酯类杂质的标准品溶液、250μl待测液和475μl水，定量环中的混合液中乙腈的体积含量为20%。

27、优选地，所述磷酸溶液中磷酸的质量浓度为0.1%。

28、优选地，所述对甲苯磺酸酯类杂质的标准品溶液包括对甲苯磺酸酯类杂质的标准品和乙腈；所述待测液中的溶剂为体积浓度为50%的乙腈水溶液。

29、本发明提供了一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法，包括以下步骤：将待测液依次进行一维液相分离和二维液相分离，得到对甲苯磺酸酯类杂质的色谱图；所述对甲苯磺酸酯类杂质包括对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯中的一种或几种；根据所述对甲苯磺酸酯类杂质的色谱图与预定的标准曲线，得到对甲苯磺酸酯类杂质的含量；所述预定的标准曲线为对甲苯磺酸酯类杂质的浓度和峰面积的线性关系；所述一维液相分离的条件包括：进样方式为分段进样；富集柱为c8柱；一维流动相a为磷酸溶液；一维流动相b为乙腈；一维梯度洗脱的程序为：0~5min：所述流动相a的体积百分含量由80%匀速减少到20%；5~12min：所述流动相a的体积百分含量为20%；12~12.5min：所述流动相a的体积百分含量由20%匀速增加到80%；12.5~20min：所述流动相a的体积百分含量为80%；所述二维液相分离的色谱条件包括：色谱柱为五氟苯基色谱柱；柱温：30℃；二维流动相a为水；二维流动相b为乙腈；流速为1ml/min；二维梯度洗脱的程序为：0~7.5min：所述流动相a的体积百分含量为80%；7.5~8.5min：所述流动相a的体积百分含量由80%匀速减少到40%；8.5~12min：所述流动相a的体积百分含量为40%；12~12.5min：所述流动相a的体积百分含量由40%匀速减少到20%；12.5~14min：所述流动相a的体积百分含量为20%；14~14.5min：所述流动相a的体积百分含量由20%匀速减少到5%；14.5~18min：所述流动相a的体积百分含量为5%；18~19min：所述流动相a的体积百分含量由5%匀速增加到80%；19~20min：所述流动相a的体积百分含量为80%；检测条件为：检测器为2个二极管阵列检测器；波长为225nm。本发明通过一维分离，使大量药物活性成分（api）被洗脱，而对甲苯磺酸酯类杂质被保留在色谱柱上。一些与对甲苯磺酸成盐的药物，在酸性条件下可水解为离子型，在反相固相萃取柱上可快速洗脱。因此，通过流动相从高水相(0.1wt%磷酸)增加到高有机相，从而将对甲苯磺酸酯类杂质洗脱至色谱柱，利用二维分离和定量对甲苯磺酸类杂质。由于严格限定了分离条件并采用uv检测器，干扰因素很少，重现性高。

技术特征：

1.一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述富集柱为capcell pak c8。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为welch ultimate pfp色谱柱。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述分段进样为进样4个循环至定量环；每个循环为依次进样25μl对甲苯磺酸酯类杂质的标准品溶液、250μl待测液和475μl水，定量环中的混合液中乙腈的体积含量为20%。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸溶液中磷酸的质量浓度为0.1%。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述对甲苯磺酸酯类杂质的标准品溶液包括对甲苯磺酸酯类杂质的标准品和乙腈；所述待测液中的溶剂为体积浓度为50%的乙腈水溶液。

技术总结
本发明属于分析化学技术领域，涉及一种原料药中对甲苯磺酸酯类基因毒杂质的检测方法。本发明通过一维分离，使大量药物活性成分（API）被洗脱，而对甲苯磺酸酯类杂质被保留在色谱柱上。一些与对甲苯磺酸成盐的药物，在酸性条件下可水解为离子型，在反相固相萃取柱上可快速洗脱。因此，通过流动相从高水相(0.1wt%磷酸)增加到高有机相，从而将对甲苯磺酸酯类杂质洗脱至色谱柱，利用二维分离和定量对甲苯磺酸类杂质。因此，本发明提供的方法抗干扰性好，重现性高。

技术研发人员：山广志,姜艺菲,左利民,朱志玲,李怡然,赵学佳,孙胜男,赵婷,连晓芳,刘惠一
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15