一种油料中香精香料的测定方法与应用与流程

本发明属于香精香料检测，具体涉及一种同时测定油料中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的方法，还涉及该方法在测定油菜籽、芝麻、花生等油料中香精香料含量中的应用。

背景技术：

1、油料是含有大量脂肪，可用于提取油脂的一类作物。花生、芝麻和油菜籽是我国食用油的主要油料作物，其种子生长成熟、后期油料储藏、加工和油脂生产等环节都会有香料的变化。

2、香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪是食品中常用的增香剂，被广泛用于食品工业生产中，具有改良食品风味、修饰苦味、改善口感的作用，同时还有用量极少，增香效果显著的特点。但是研究表明大剂量的香精香料摄入可能会导致人产生头晕、恶心、呕吐等不良症状，严重的甚至会引起人体肝肾等器官的损伤。目前gb2760-2014《食品安全国家标准-食品添加剂使用标准》中严格规定了香兰素等香精香料的使用限量，并且规定了植物油脂、动物油脂等食品中不得添加。然而，不法商贩为了达到以次充好、以假乱真的目的，在食品中违法添加此类物质。

3、同时，也有研究结果表明，食用植物油中存在内源性香料，如芝麻油、菜籽油中天然存在香兰素，而这些食用油中的香兰素可能来源于油料作物或油脂加工过程。因此，为了甄别食用油中香料的真实来源，同时基于日常监管需要，建立油料作物中香料的检测方法迫在眉睫。

4、目前，对于油料中香精香料的含量水平和检测相关信息较少，主要集中在油脂及其下游产品奶粉中。香精香料的前处理提取技术主要有固相萃取技术、蒸馏萃取法、搅拌棒吸附萃取法、溶剂辅助风味蒸发法、静态顶空法等，香料的分析技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、电化学法、离子色谱法、电子鼻和电子舌法等，这些方法能同时测量5种香精香料的较少，提取效率不高。gb5009.284-2021《食品安全国家标准食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》及bjs 201705《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》能同时检测3种物质，但其检测基质主要是乳制品、糕点、糖果、饮料、油脂等，不包含富含油脂的油料作物，同时，这些标准使用的仪器较昂贵，成本较高，不适合基层监管和企业开展常态监测。

5、此外，油料作物既富含大量油脂又有较多纤维类物质，基质复杂，如果不经净化直接进入仪器会引起严重的基质抑制，甚至会污染整个仪器系统，故样品制备难度大。为避免基质干扰和准确定量，多种香精香料的检测一般使用昂贵的质谱测定，方法运行成本较高，不适合基层和工厂开展检测，如何使用低成本的仪器进行准确定量是一种挑战。

6、基于此，提供一种针对油料作物中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪五种香料进行同时检测的方法，更加方便快捷、高精密度、高准确度实现油料作物内源性香料和外源性香精的检测，对于油料品质评判和食用油安全性监管具有重要的意义，也是亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种同时测定油料中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的方法。

2、本发明的目的之二在于提供一种油料中香精香料的测定方法在测定油菜籽、芝麻、花生等油料中香精香料含量中的应用。

3、本发明实现目的之一采用的技术方案是：提供一种油料中香精香料的测定方法，包括以下步骤：

4、s1、样品前处理：将粉碎后的油料与水混合，而后加入乙腈，超声处理，得到第一混合物；向第一混合物中先后加入氯化钠和正己烷，得到第二混合物；将第二混合物固液分离，取中间液；将中间液氮吹处理，得到第一残渣，利用甲醇溶解第一残渣，加水定容，得到样液；

5、s2、净化和提纯：将所述样液通过固相萃取柱，而后加水淋洗、洗脱，收集洗脱液；将洗脱液氮吹处理，得到第二残渣；利用甲醇溶解第二残渣，过微孔滤膜，得到滤液；

6、s3、分析测试：将所述滤液注入气相色谱进行检测，根据检测结果对其所含的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪进行定性定量分析。

7、本发明提供的一种油料中香精香料的测定方法的总体思路如下：

8、本发明针对现有的适用于植物油的香精香料检测方法用于检测对油料作物内源性香料时存在的：基质复杂、易污染、样品制备难度大、运行成本高、干扰因素多等问题，提供了一种针对油料中所含香精香料准确定量的检测方法。该方法包括样品前处理、净化和提纯，以及分析测试三个主要步骤。通过对样品进行前处理，对杂质进行有效去除，避免了油料中脂质和蛋白质的存在对目标香精香料提取效率的影响；通过前处理操作，使样液得到了更好的净化效果，为提高检测灵敏度、降低了检出限和定量限提供必要的前提保障。进一步地，本发明还建立了固相萃取-气相色谱的分析方法，通过合理的净化提纯路径配合分析测试手段，满足了对于油料作物五种香精精料(香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪)同时进行准确定量的检测需求。

9、在本发明步骤s1中，考虑到油料属于富含脂肪的食品，其含有大量的脂肪和蛋白质，会导致提取的溶液含有一定的脂质，将极大地影响目标香精精料的提取效率，而且会对定量检测仪器的性能产生不利影响。本发明步骤s1中对粉碎后的样品先用水、乙腈分别提取，再辅以氯化钠和正己烷处理，最后固液分离实现去脂去杂，取固液分离得到的中间层的液体(中间液)氮吹处理后加甲醇溶解，制备得到高纯度的样液，不仅有助于提高后续固相萃取操作的提取效率，而且避免杂质对固相萃取柱和仪器造成污染和损伤。

10、在步骤s1中，氯化钠的加入能够促进正己烷、乙腈和水在后续的处理中分层效果，提高正己烷的油脂携带量，进而降低固液分离后得到的中间层的油脂含量，不仅便于后续的提取净化，也避免了油脂残留对仪器造成的污染。

11、进一步地，步骤s1中，将油料利用粉碎机粉碎处理，并过30目筛，得到粉碎后的油料的粒径为100～600μm。

12、优选地，粉碎后的油料与水的质量体积之比为1:(1～5)g/ml；粉碎后的油料与乙腈的质量体积之比为1:(5～10)g/ml。优选地，粉碎后的油料与水的质量体积之比为2:5g/ml；粉碎后的油料与乙腈的质量体积之比为1:10g/ml；加入乙腈后超声处理的时间为10～40min。

13、进一步地，步骤s1中，粉碎后的油料与氯化钠的质量比为1：(1～3)；粉碎后的油料与正己烷的质量体积之比为1：(1～5)g/ml。优选地，粉碎后的油料与氯化钠的质量比为2:3；粉碎后的油料与正己烷的质量体积之比为2:3g/ml。

14、进一步地，步骤s1中，所述固液分离采用离心的方式进行，离心的转速为2000～9000r/min，离心的时间为5～20min。优选地，离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为8～12min。

15、优选地，步骤s1中，加入水、乙腈、氯化钠、正己烷后，分别采用涡旋振荡的方式进行混合，涡旋振荡的时间为0.5～2min。

16、进一步地，步骤s1中，将中间液采用氮吹(将氮气吹入加热样品的表面进行样品浓缩和干燥)的方式进行处理，所述氮吹的温度为30～50℃。

17、在本发明步骤s2中，对样液进行净化和提纯，经过去脂去杂的样液经固相萃取小柱净化，极性色谱柱分离，具有基质干扰小、分析速度快的优势。

18、进一步地，步骤s2中，所述固相萃取柱采用c18固相萃取柱lc-c18(1g/6ml)；所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

19、进一步地，步骤s2中，所述样液在固相萃取柱中的流速为0.1～2ml/min；所述洗脱的洗脱液为甲醇和水按照(2～5):1的体积比组成的混合溶液；所述氮吹的温度为30～50℃。优选地，所述洗脱液为甲醇和水按照4:1的体积比组成的混合溶液。

20、进一步地，步骤s3中，所述将所述滤液注入气相色谱进行检测之前，还包括：配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的混合标准工作溶液，将所述混合标准工作溶液采用气相色谱法进行测定，得到五种香精香料的标准曲线。

21、进一步地，将待测溶液(滤液)按照与混合标准工作溶液按照相同的仪器参数进行检测，获得试样中香精香料的色谱图，然后进行定性定量分析。

22、进一步地，步骤s3中，所述气相色谱采用cd-wax毛细管柱，尺寸为30m×0.25mm×0.25um，cd-wax毛细管柱应用于油料中5种香料的测定，具有目标物灵敏度高、重现性好的优势。

23、所述气相色谱的条件包括：进样口温度为260～280℃，柱初始温度为70～90℃，并逐级升温至230～250℃。优选地，气相色谱的条件具体如下：采用程序升温，柱初始温度70～90℃，保持1～10min，以5～10℃/min速率升温至200～230℃，保持1～10min，再以10～30℃/min速率升温至230～250℃，保持1～10min；fid检测器温度270～300℃。

24、进一步地，进样过程采用不分流进样，进样流量为1.0～3.0ml/min，进样量1～2μl。采用氮气作为载气，氮气流量：10～40ml/min；fid检测器的助燃气中，氢气流量为350～400ml/min；空气流量：35～40ml/min。

25、在本发明步骤s3中，采用独特的升温程序结合适宜的载气流量能很好分离五种性质相似的香精香料，同时避免基质中其他物质的干扰，出峰时间较短，峰形对称且尖锐。优选地，载气氮气流量为25ml/min；检测器的助燃气中，氢气流量为400ml/min，空气流量为40ml/min。

26、进一步地，本发明采用外标法进行定量。

27、本发明实现目的之二采用的技术方案是：提供一种根据本发明目的之一所述的测定方法在测定油料中香精香料含量中的应用。

28、进一步地，所述油料包括油菜籽、芝麻、花生、葵花籽、大豆中的一种或多种的组合。

29、进一步地，所述香精香料包括香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

31、(1)本发明提供的一种油料中香精香料的测定方法，包括样品前处理、净化和提纯，以及分析测试三个主要步骤。在样品前处理阶段，利用水、乙腈分别提取，辅以氯化钠和正己烷处理，结合固液分离实现去脂去杂，避免了油料中脂质和蛋白质的存在对目标香精香料提取效率的影响，使样液得到了更好的净化效果，为提高检测灵敏度、降低了检出限和定量限提供必要的前提保障。进一步地，本发明还建立了固相萃取-气相色谱的分析方法，提取液经c18固相萃取小柱净化，极性色谱柱分离，具有基质干扰小、分析速度快的优势。通过合理的净化提纯路径配合分析测试手段，满足了对于油料作物五种香精香料同时进行准确定量的检测需求。

32、(2)本发明提供的一种油料中香精香料的测定方法，针对目前国内外严重缺少关于油料中香精香料检测方法的研究，提供了一种能够同时测定油料中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的方法，该方法实现前处理操作简单、净化效果好、灵敏度更高的定量检测，为油料品质评判和食用油安全性监管提供了技术支撑。