一种基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法

本发明涉及湖泊沉积物中解磷菌的活性研究，具体涉及一种基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法。

背景技术：

1、磷是维持生命活动的重要营养元素之一，另一方面，磷还是大多数水体富营养化和有害藻类暴发的重要诱因。此外，当湖泊等水体外部污染得到有效控制时，水中沉积物内部释放的磷可以长期成为水中磷的主要来源。磷以多种形式存在于水体中，例如可溶性磷、不可溶性磷、有机磷或无机磷。解磷菌能够将沉积物中的难溶性磷化合物溶解释放至水体，其介导的磷转化释放过程与藻类爆发、水华等水环境灾害直接相关，因此解磷菌在水体磷循环过程中的作用机制越来越受到关注。

2、湖泊沉积物中难溶性磷能够在适宜条件下释放到间隙水和上覆水体中，在此过程中，解磷菌起着关键作用。研究表明，将解磷菌接种至湖泊沉积物，可明显增加水体中可溶性磷的含量，促进微囊藻等水华藻的生长。解磷菌包括解磷细菌、真菌和放线菌等，其中解磷细菌的种类和数量较多，研究也较深入。解磷细菌(psb)分为无机解磷菌(ipsb)和有机解磷菌(opsb)，也存在同时可以分解难溶性无机磷、难溶性有机磷的解磷菌。解磷菌的解磷机制较为复杂，能够在生长过程中向外分泌各种小分子酸类物质、质子、多糖、酶等物质以分解难溶性磷，通过分泌磷酸酶分解有机磷源，通过产生有机酸分解无机磷源，或者通过调节ph使环境中的难溶性磷酸盐溶解。

3、解磷菌的解磷活性决定了湖泊沉积物内源磷的释放潜力。现有技术中，对解磷菌活性的研究一般针对土壤解磷菌，并且大多采用先培养再筛选的研究方法，需要进行多代培养才能够筛选得到解磷菌，这种方法应用到湖泊沉积物环境的解磷菌活性研究中，只能获取非常少量的解磷菌株，培养时间较为漫长，且实验室纯培养的结果与真实情况存在较大差异。

4、因此，需要建立一种合理的检测方法，以适用于湖泊沉积物环境中的目标解磷菌并准确检测其解磷活性，进而准确评估具有解磷功能的微生物对湖泊沉积物中的内源磷的释放驱动潜力，提高湖泊富营养化的监测预警能力。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于上述技术问题，为了解决现有技术中存在的目前的检测方法无法有效适用于水体沉积物环境中的解磷菌活性检测，检测结果存在较大偏差的问题，本发明提供一种基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法。

3、(二)技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、一种基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，包括如下步骤：

6、s1：在湖泊底部获取沉积物样品，将沉积物样品放置在厌氧环境中，保持与湖泊底部相同的温度进行运输；

7、s2：对沉积物样品进行前处理，得到含有微生物的待测物；

8、s3：将待测物加入含有d2o、碳源、难溶性磷源的培养基中培养；

9、s4：通过单细胞拉曼光谱技术检测待测物的拉曼光谱数据，然后绘制得到拉曼光谱图；

10、s5：根据拉曼光谱图，计算碳-氘拉曼条带对应的积分面积占碳-氘拉曼条带以及碳-氢拉曼条带对应的积分面积加和的比率，作为解磷菌活性的半定量评价指标。

11、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s1中，获得沉积物样品后，运输过程中，将沉积物样品置于氮气环境中。

12、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s2中，通过密度梯度离心法对沉积物样品进行离心处理，然后通过滤膜对离心后的液体进行过滤，提取其中的微生物，得到含有微生物的液相待测物。

13、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s3中，培养基中d2o的体积比为30-50％。

14、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s3中，培养温度为37℃，培养时长为24-48h。

15、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s3中，碳源为葡萄糖，难溶性磷源为ca3(po4)2和/或卵磷脂。

16、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s4中，培养结束后，对培养基进行取样、离心，然后进行细胞重悬处理，得到微生物溶液，取微生物溶液滴在拉曼板上，风干后检测待测物的拉曼光谱数据，通过软件对拉曼光谱数据进行处理，得到拉曼光谱图。

17、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s4中，在显微镜放大倍数为10-1000，镜口率为0.1-0.9，激光强度为0-100mw的条件下，使用400-500gr/mm衍射光栅，设置每个点的积分时间为1-200s，积累次数1-100次，扫描范围为500-3200cm-1，检测待测物的拉曼光谱数据。

18、如上所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，优选地，步骤s5中，碳-氘拉曼条带对应的波数范围为2040-2300cm-1，碳-氢拉曼条带对应的波数范围为2800-3100cm-1。

19、(三)有益效果

20、第一，本发明将单细胞拉曼光谱-氘稳定同位素标记技术用于水体沉积物环境中的解磷菌活性检测。解磷菌通过生物代谢摄入重水(d2o)中的氘元素后，可以将其结合到细胞中，新合成的生物分子的化学键中用较重的氘元素取代了原始同位素氢，细胞内蛋白质、脂类、细胞色素等的拉曼光谱会出现与同位素摄入量成正比的拉曼偏移，在拉曼光谱中会显示出较强并且容易识别的的碳-氘拉曼条带。所以，单细胞拉曼光谱技术能够直接表征微生物复杂菌群中的解磷菌活性。本发明将单细胞拉曼技术和同位素标记的方法进行结合，在较短时间内实现解磷菌的原位活性检测，并且得到的检测结果更加精准，更加接近真实湖泊环境中的活性，更具有代表性。

21、第二，本发明在取样之后的运输过程中维持了湖泊底部的厌氧环境，以及湖泊底部的温度环境，使样品中的微生物，尤其是解磷菌能够保持湖泊底部的原始状态。

22、第三，本发明还建立了新的解磷菌活性评价指标，具体以拉曼光谱图中的碳-氘拉曼条带对应的积分面积占碳-氘拉曼条以及碳-氢拉曼条对应的总积分面积的比率作为解磷菌活性的半定量评价标准，在检测后能够快速反馈解磷菌的活性，对湖泊中藻类爆发具有较好的监测预警效果。

技术特征：

1.一种基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s1中，获得沉积物样品后，运输过程中，将沉积物样品置于氮气环境中。

3.根据权利要求1所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s2中，通过密度梯度离心法对沉积物样品进行离心处理，然后通过滤膜对离心后的液体进行过滤，提取其中的微生物，得到含有微生物的液相待测物。

4.根据权利要求1所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s3中，培养基中d2o的体积比为30-50％。

5.根据权利要求4所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s3中，培养温度为37℃，培养时长为24-48h。

6.根据权利要求1所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s3中，碳源为葡萄糖，难溶性磷源为ca3(po4)2和/或卵磷脂。

7.根据权利要求1所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s4中，培养结束后，对培养基进行取样、离心，然后进行细胞重悬处理，得到微生物溶液，取微生物溶液滴在拉曼板上，风干后检测待测物的拉曼光谱数据，通过软件对拉曼光谱数据进行处理，得到拉曼光谱图。

8.根据权利要求7所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s4中，在显微镜放大倍数为10-1000，镜口率为0.1-0.9，激光强度为0-100mw的条件下，使用400-500gr/mm衍射光栅，设置每个点的积分时间为1-200s，积累次数1-100次，扫描范围为500-3200cm-1，检测待测物的拉曼光谱数据。

9.根据权利要求8所述的基于单细胞拉曼-同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，其特征在于，步骤s5中，碳-氘拉曼条带对应的波数范围为2040-2300cm-1，碳-氢拉曼条带对应的波数范围为2800-3100cm-1。

技术总结
本发明涉及一种基于单细胞拉曼‑同位素标记的湖泊沉积物中解磷菌的活性检测方法，包括如下步骤：S1：湖泊底部取样，运输中保持厌氧环境以及与湖底相同的温度。S2：对沉积物样品进行前处理，得到含有微生物的待测物。S3：将待测物加入含有D<subgt;2</subgt;O、碳源、难溶性磷源的培养基中培养。S4：检测待测物的拉曼光谱数据，绘制得到拉曼光谱图。S5：根据拉曼光谱图，计算碳‑氘拉曼条带对应的积分面积占碳‑氘拉曼条带和碳‑氢拉曼条带对应的总积分面积的比率，作为解磷菌活性的半定量评价指标。本发明将单细胞拉曼光谱与同位素标记进行结合，根据碳‑氘拉曼条带所占比率较为反映解磷菌的活性，并且实现了湖泊底部的原位检测效果，检测更加准确。

技术研发人员：孔令超,王艺,郑春苗,裘文慧
受保护的技术使用者：南方科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12