水果中展青霉素的比率型分子印迹电化学传感检测方法及其修饰电极

本发明涉及食品安全检测，特别是涉及一种水果中展青霉素的比率型分子印迹电化学传感检测方法及其修饰电极。

背景技术：

1、展青霉素(patulin,pat)是一种产自青霉属或曲霉属真菌的真菌毒素，它们通常生长在蔬果以及制品中。人们最早将其作为抗生素使用，但很快就发现该物质会引起动物体的组织水肿、溃疡、肠道炎症和上皮细胞变性等一系列的健康风险。因此，除了不再将pat当作抗生素使用外，各国也严格限制了农产品中pat的最大残留限量(mrl)。例如，欧盟规定食品中pat的含量不得超过10μg/kg，我国也规定水果及其制品中pat的mrl为50μg/kg，因而对农产品中pat含量的监测是十分重要的。

2、由于大的表面积以及良好的电化学活性，mxene被广泛用于电化学传感器(ecs)的构建。虽然mxene的定义是一类过渡金属碳化物或氮化物，但是最多的报道是ti3c2，其次是其他碳基mxene，而氮基mxene却很少报道。究其原因，是因为常规的碳基mxene一般均可由hf水溶液刻蚀对应的max相得到，而氮基mxene在hf水溶液中较为不稳定，因此很难成功制备出片状氮基mxene。但是相比碳基mxene，氮基mxene具有更好的导电性，因此更利于构建高传感性能的ecs。

3、因特异性强、成本低、操作简单、灵敏度高等诸多优点，分子印迹电化学传感器(mips-ecs)检测真菌毒素的研究已有较多报道。目前大多数mips-ecs均采用单信号输出模式，即利用真菌毒素自身经过电催化产生的单个氧化还原信号，但是展青霉素电活性较低以至于无法获得较低的检测限，所以人们将探针分子引入到mips-ecs中。其中，以[fe(cn)6]4-/3-为探针分子的居多，但是体积小的探针分子进入印迹孔洞后由于毛细吸附现象而不能有效洗脱，最终造成检测重复性差等问题。但是，无论是采用自身的氧化还原信号还是探针分子信号来构建传感器，一般都是采用单信号输出模式。单信号输出模式容易受到诸如电极制备与人为操作差异等内在因素，以及基质效应与外界环境变化等外部因素的影响，导致传感器不可避免地存在重复性差和再现性低的问题。另外一部分人赋予传感器一个内置的校正机制，也就是双信号输出模式下的比率型传感器，这样可显著消除背景电流等系统误差和外界环境变化等外部因素的影响，从而提高了传感器的稳定性和重复性。但是目前所采取的比率型分子印迹电化学传感器(mips-recs)大多采用探针分子与检测物电化学氧化还原信号为双信号，但是这种方法也无法消除分子印迹传感器重复使用后分子印迹膜稳定性降低导致数据可靠性差的问题。因此，人们探索出一些功能单体，通过它们自身的氧化还原信号来代表分子印迹膜稳定的标志，以此来判定分子印迹传感器目前数据的可靠性。目前，采用这类功能单体与探针分子构建mips-recs对展青霉素进行监测的工作几乎没有。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种水果中展青霉素的比率型分子印迹电化学传感检测方法及其修饰电极。

2、与传统的以[fe(cn)6]4-/3-为探针分子相比，本发明将银离子在mxene纳米片上通过原位过程还原成银纳米颗粒(agnps)，使得agnps不仅能增强分子印迹传感器的导电性，还能提供比[fe(cn)6]4-/3-更稳定的电化学信号。而且，为了解决单信号输出模式存在的重复性差和再现性低等问题，本发明通过在原有的分子印迹传感基础上，引入一个既能与检测物形成印迹分子膜，又具有内部校准功能的内参比信号的功能单体，构成双信号输出模式(另一信号为与检测目标物浓度呈相关性的agnps信号)。本发明所构建的展青霉素检测方法稳定性好，重复性高，可靠性强。

3、本发明的修饰电极是利用agnps@ti2ntx@il纳米复合材料开发的新型mips-recs。本发明通过刻蚀和超声辅助的方法合成了agnps@ti2ntx@il纳米复合材料，并以该纳米复合材料为基底材料，thi为功能单体，pat为模板分子，通过电聚合的方法制备了高灵敏检测pat的mips-recs。在该传感器中，分别利用agnps和thi产生的信号作工作信号和参比信号，成功构建了比率型的mips-recs。研究结果表明，本发明的传感器具有优异的特异性，稳定性以及抗干扰能力，并展现出良好的实际应用前景。

4、具体而言，本技术提供了如下技术方案：

5、一种用于检测水果中展青霉素的修饰电极的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)基底工作电极抛光处理

7、1.1打磨工作电极：首先采用氧化铝抛光粉将工作电极打磨成镜面，再将打磨成镜面的工作电极分别在蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中依次超声清洗，以彻底去除吸附在工作电极表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后在冷空气中吹干；

8、1.2判断电极打磨合格：将步骤1.1中吹干的工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于电化学探针溶液中，利用循环伏安法扫描，并与理论标准谱对照两峰之间的电位差在规定范围内即电极打磨合格；

9、(2)agnps@ti2ntx@il纳米复合材料的合成

10、2.1ti2ntx的合成

11、采用kf-hcl混合液作刻蚀剂来制备ti2ntx纳米片。首先，取10ml所配置好的kf-hcl混合液加入到装有1g ti2aln粉末的离心管中，并在室温条件下反应3h，之后置于超声机中超声处理1h。将所得到的悬浊液通过离心洗涤至中性(6000rpm，每次5min)，待洗涤完成后，使用异丙醇重悬，再以6000rpm离心30min，之后收集离心产物并置于真空干燥箱干燥，即可得到多层ti2ntx。称取100mg多层ti2ntx,分散在10ml dmso溶液中，置于超声机中超声处理1h，以便多层ti2ntx进一步分层。剥离结束后先通过6000rpm离心30min除去dmso溶液，再将所获得的产物用去离子水重悬，之后通过3500rpm离心30min收集上清液，最后将上清液置于真空冷冻干燥箱中冷冻干燥48h，即可获得ti2ntx纳米片粉末。

12、2.2il双烯丙基六氟磷酸盐的合成

13、首先，将20mmol的n-烯丙基咪唑溶于25ml甲苯中，然后在75℃搅拌下滴入10mmol的1，4-二溴丁烷。连续搅拌24h，之后冷却至室温。反应完成后，倒出上层溶液，将产物分别使用乙酸乙酯和乙醚洗涤3次。然后将所得产品60℃真空干燥1h，即可得到双烯丙基咪唑溴盐。之后取3mmol双烯丙基咪唑溴盐溶解在30ml去离子水中，并加入6mmol六氟磷酸钾，在85℃下搅拌6h，即可得到il双烯丙基六氟磷酸盐。

14、2.3超声辅助的方法合成agnps@ti2ntx@il纳米复合材料

15、首先，称取10mg ti2ntx粉末分散在2.5ml，浓度为10mm agno3溶液中，在超声的作用下反应1h，即可得到agnps@ti2ntx复合材料。与此同时，称取30mg il用2.5ml dmso溶解。然后向agnps@ti2ntx悬浊液中加入所配制的il溶液，继续超声处理1h从而获得agnps@ti2ntx@il悬浊液。将获得的悬浊液离心洗涤数次，待洗涤完成后，将离心所得沉淀物置于真空冷冻干燥箱中冷冻干燥48h后，即可获得agnps@ti2ntx@il纳米复合材料粉末。称取2mgagnps@ti2ntx@il纳米复合材料粉末用1.0ml dmf与水体积比1：1的混合溶液分散，即可获得agnps@ti2ntx@il悬浊液。

16、(3)mip/agnps@ti2ntx@il/gce的构建

17、改性之前将gce仔细抛光，并用去离子水超声清洗。然后将5.0μl agnps@ti2ntx@il悬浊液滴在gce的清洁表面上，之后置于红外烘箱中干燥。待电极冷却至室温，将制备好的agnps@ti2ntx@il/gce浸泡在含有1.0mm pat和6.0mm功能单体的电解质溶液中。搭建三电极系统，采用cv进行电聚合，扫描速率为100mv/s，电位范围为-0.85～0.85v，循环20次。电聚合结束后，将改性gce浸泡在2.0m硫酸中6min，以便去除pat分子。最后，用去离子水小心地清洗改性gce，并置在钨丝灯下烘干，将得到的电极标记为mip/agnps@ti2ntx@il/gce。

18、进一步地，所述步骤1.1中，所述氧化铝抛光粉的粒径为0.04～0.06μm。

19、进一步地，所述步骤1.2中，工作电极为玻碳电极、石墨电极、金电极或铂电极中的任意一种。

20、进一步地，所述步骤1.2中，参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极。

21、进一步地，所述步骤1.2中，对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中任意一种。优选地，所述对电极为铂、金或钨。

22、进一步地，所述步骤1.2中，电化学探针溶液为含有0.1mol/l kcl的5mmol/l[fe(cn)6]3-/4-溶液或含有0.1mol/l kcl的5mmol/l[ru(nh3)6]2+/3+溶液。

23、进一步地，所述步骤1.2中，规定范围内是指100mv以下。

24、进一步地，所述步骤(3)中，所述电解质溶液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液或br缓冲液。

25、进一步地，所述步骤(3)中，所述功能单体为硫堇、亚甲基蓝、对氨基苯硫酚和吡咯中任意一种。

26、采用上述方法制得的修饰电极对水果中展青霉素进行比率型分子印迹电化学传感检测的方法，包括以下步骤：

27、(1)建立pat检测标准工作曲线：

28、①在电解池中配制不参与化学反应且导电的溶液作为电解质溶液，向电解质溶液中通入惰性气体；

29、②将pat溶于可溶解且不与pat发生作用的溶剂中，配成pat标准母液；

30、③将mip/agnps@ti2ntx@il/gce修饰电极、参比电极及对电极置于步骤①经惰性气体处理的电解质溶液中，采用方波伏安法(swv)进行检测得孵育pat前的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)；将mip/agnps@ti2ntx@il/gce修饰电极置于步骤①经惰性气体处理的电解质溶液中，而后向电解质溶液中加入不同体积、一定浓度的步骤②制备的pat标准母液，搅拌孵育后取出用去离子水冲洗非特异性吸附的pat，静置干燥后将孵育后的修饰电极、参比电极及对电极置于优化ph后的电解质溶液中，采用方波伏安法进行检测得孵育pat后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)；使用孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)比值的差值[δ(iag/ithi)]来与孵育pat的浓度建立线性关系，以pat浓度为横坐标，以孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)比值的差值[δ(iag/ithi)]为纵坐标，建立pat检测标准工作曲线。

31、(2)样品中pat快速定量分析：

32、在一定体积含有未知pat浓度的溶液中加入步骤①经惰性气体处理的电解质溶液，并调节实验参数条件，而后将本发明制得的mip/agnps@ti2ntx@il/gce修饰电极浸没在溶液中进行孵育，孵育后采用去离子水冲洗非特异性吸附的pat，静置干燥后将孵育后的修饰电极、参比电极及对电极置于优化ph后的电解质溶液中，采用方波伏安法测定孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)，最后根据步骤(1)建立的pat检测标准工作曲线，即得实际样品中的未知pat浓度。

33、进一步地，所述电解质溶液为磷酸盐缓冲溶液；优选地，在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液为0.1mol/l的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠混合溶液。

34、进一步地，所述惰性气体为氮气、氦气或氖气。

35、进一步地，所述pat标准母液的制备方法为：将pat溶于乙醇中，配成浓度为10.00mg/ml的pat标准母液。

36、进一步地，所述参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，所述对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中任意一种。

37、与现有技术相比，本发明水果中展青霉素的比率型分子印迹电化学传感检测方法及其修饰电极至少具有以下有益效果：

38、(1)本发明以电聚合法直接在工作电极上聚合mip。通过孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)判断pat浓度，随着加入的pat浓度越高，ag氧化峰电流(iag)就会越小，而内参比信号峰thi氧化峰电流(ithi)电流保持不变，因此可以利用两个检测信号的比值可以减少仪器或环境的误差，从而为pat的痕量分析提供更准确的检测结果。

39、(2)本发明使用孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)比值的差值[δ(iag/ithi)]来与孵育pat的浓度建立线性关系，以pat的浓度为横坐标，以孵育pat前后的ag氧化峰电流(iag)与thi氧化峰电流(ithi)比值的差值[δ(iag/ithi)]为纵坐标，建立了pat检测标准工作曲线，通过pat检测标准工作曲线测量未知浓度pat，方法简单，操作便捷，检测快速，重复性和重现性好，抗干扰能力强，可用于苹果、梨等实际样品中pat快速定量检测。

40、下面结合附图对本发明水果中展青霉素的比率型分子印迹电化学传感检测方法及其修饰电极作进一步说明。