一种亚硝酸盐快速检测试剂盒以及检测方法与流程

本技术涉及试剂盒的领域，尤其是涉及一种亚硝酸盐快速检测试剂盒以及检测方法。

背景技术：

1、亚硝酸盐是含有亚硝酸根阴离子(no2-)的盐，易溶于水，最常见的是亚硝酸钠。人体摄入0.3～0.5克的亚硝酸盐即可引起中毒，3克导致死亡。亚硝酸盐中毒通常由于食用亚硝酸盐含量较高的腌制肉制品、泡菜、变质的蔬菜等食物，或饮用含有亚硝酸盐的水等引起。对食物或饮水进行亚硝酸盐快速检测，以避免摄入过多亚硝酸盐，有益于身体健康。

2、除了饮食来源之外，人体内的亚硝酸盐可由一氧化氮(no)转化而来。no是一种半衰期仅约3秒的脂溶性小分子自由基，在体内可以自由透过细胞膜扩散。体内的no是在一氧化氮合酶(nos)催化l-精氨酸氧化脱氨基转化为瓜氨酸的过程中产生。人体nos包括神经元型(nnos)、内皮细胞型(enos)和诱导型(inos)等3种。nnos和enos活性较低，产生低浓度no。鸟苷酸环化酶(sgc)是低浓度no的主要作用靶点。no结合激活sgc，致使细胞cgmp水平升高，进而引发一系列的生理效应。inos活性远高于nnos和enos，能够催化产生应激性高浓度no。健康状态下inos通常仅少量表达，而在炎症条件下显著表达上调，产生过量no，一方面具有杀菌、抗感染、舒张平滑肌等作用，另一方面，也参与介导促进炎症反应，造成细胞和组织损伤。气道no检测在气道感染和炎症检测，尤其在哮喘研究中得到了重点关注。由于no很不稳定，气道no绝大部分转化为亚硝酸盐溶解并比较稳定地存在于气道粘(黏)液中。气道粘液是一种覆盖于气道内表面的体液和凝胶状保护层，包含气道黏(粘)蛋白、水分和无机盐等成份。通过气道粘液样本中亚硝酸盐的检测可指示气道no水平。

3、哮喘是一种以持续存在的慢性气道炎症及气道高反应性(ahr)为特征的慢性肺病，具隐蔽性和突发性，尤其对儿童的危害很大。进行安全无创、便利易用的体检早筛和监测是扭转哮喘严峻局面的关键。现有手段以肺功能检查、igg检测和诱导痰细胞检查为主，存在专业性强，干扰因素多，效率偏低等缺陷，不易普及；肺功能支气管激发试验和诱导痰还存在刺激性安全风险；igg检测也需要采血，儿童比较抗拒，且只指示过敏，应用于哮喘检测的灵敏度和特异度有限，不利于筛查和监测应用。研究显示，气道no水平与哮喘本质的气道嗜酸性粒细胞炎症及气道高反应性密切相关，哮喘患者气道no含量可达健康人群的2-5倍，气道no相关检测不仅可用于哮喘筛查，还可用于指示哮喘气道炎症变化和评估糖皮质激素治疗，灵敏度优于肺功能或诱导痰检查。通过发展简便快速的亚硝酸盐检测方法和产品，有望为哮喘体检早筛和监测提供有力的气道no检测普及工具。

4、现有的亚硝酸盐和no检测方法主要有吸光度法(比色法)、荧光探针法、化学发光法(鲁米诺法)、传感器法(电化学/光学)等。这些方法专业性强、难以实现即时快检(poct)，不利于普及。亚硝酸盐检测的吸光度法常规基于griess法或其改进，例如：专利申请号201811580528.5《一种一氧化氮检测方法及其应用》和专利申请号202010901322.9《一种一氧化氮检测试剂盒及检测方法》所示的方法，需经过专业训练使用微量移液器和分光光度计等专业仪器设备进行精确定量操作，没有实现poct。呼出气传感器法测定即呼出气一氧化氮(feno)检测，在临床上已得到较多应用，但受限于no气体半衰期很短和气道no绝大部分转化为亚硝酸盐(no2-)存在于气道粘液中而非呼出气中的特性，存在干扰因素多、性能波动大、对非急性发作期患者检测的灵敏度较低、需专业设备和专业指导等检测性能和便利性的不足。我们团队在中国发明专利申请202211545905.8《气道一氧化氮快速检测方法及检测试剂盒》中提供了基于griess法改进的亚硝酸盐定性便利检测的体系和方法，但仍存在部分人群尤其是儿童难以咳出样本而部分人群样本又过于粘稠难以处理等取样和处理过程易受干扰的缺陷，不利于普遍应用，同时，体系的生产工艺和检测结果显色的清晰度也需要进一步地加强改进，以利于亚硝酸盐快检在哮喘体检早筛、饮食检测、居家/社区监测等场景的普及应用。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本技术提供了一种亚硝酸盐快速检测试剂盒，旨在解决上述问题。

2、一种亚硝酸盐快速检测试剂盒，包括咽拭子采样器、采样管和检测板，所述检测板上沿自身长度方向依次间隔设置有加样孔、质控区以及检测区，所述采样管内置有样本释放剂，所述样本释放剂包括50-300mm草酸、50-300mm氯化钠、0.5-2.0mm氯化铁，所述检测板内安装有试纸条，所述试纸条上沿自身长度方向依次设置有加样区、检测指示区以及质控指示区，所述试纸条的检测指示区干燥有检测指示剂，所述检测指示剂包括2.0％-8.0％(w/v)淀粉、50-300mm磷酸氢二钠、0.5％-2.0％(w/v)brij-35、100-500mm氯化钙、100-500mm碘化钾、2.0-10.0mm 8-羟基喹啉、1-20mm硫代硫酸钠。

3、可选的，所述试纸条的质控指示区干燥有质控指示剂，所述质控指示剂包括5-30mm中性红、10-60mm碱性ph调节剂。

4、可选的，所述碱性ph调节剂为碳酸氢钠、三羟甲基氨基甲烷(tris)或乙酸钠。

5、可选的，所述试纸条上设置有中间线区，所述试纸条的中间线区上干燥有中间线试剂，所述中间线试剂包括5％-15％(w/v)brij-35、5％-15％(w/v)十二烷基硫酸钠(sds)。

6、可选的，所述样本释放剂包括200mm草酸、100mm氯化钠、2mm氯化铁。

7、可选的，所述检测指示剂包括2％(w/v)淀粉、250mm磷酸氢二钠、1％(w/v)brij-35、500mm氯化钙、250mm碘化钾、5mm 8-羟基喹啉、15mm硫代硫酸钠。

8、本技术还提供了一种亚硝酸盐快速检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

9、s1取样：以咽拭子采样器擦拭样本取样；

10、s2混合：将已取样的咽拭子采样器的取样端浸入到样本释放剂中，封紧采样管，摇晃5秒；

11、s3加样：把采样管内的液体全部滴入至检测板的加样孔内，静置至质控区变色；

12、s4：观察检测区，看检测区是否变色，若无变色，则指示样本中亚硝酸盐含量未达到检测阈值；若变色显示黑褐色，则为阳性结果，指示样本中亚硝酸盐含量达到或超过检测阈值。

13、可选的，步骤s1中：对于饮食检测，用户可直接以咽拭子采样器擦拭样本取样；对于气道粘液检测，用户在漱口清洁口腔后，拍打前胸或后背，深呼吸并咳嗽，促使少量气道粘液从气道排出并聚集到口腔内，再以咽拭子采样器插入口舌上后端，闭嘴含住3秒取样。

14、综上所述，本技术包括以下有益技术效果：

15、本发明提供的检测显色剂配方中，2.0％-8.0％(w/v)淀粉和100-500mm碘化钾提供氧化显色基础体系，此范围之外的配比均导致显色清晰度的显著下降；0.5％-2.0％(w/v)brij-35与100-500mm氯化钙的加入，能促进生产制备过程中淀粉母液的溶解和检测指示剂在试纸条t区的干燥固定，局部高浓度的brij-35能迟滞淀粉溶液的扩散，加强显色的清晰凝聚；氯化钙可以与样本液中的源自于样本释放剂的草酸根反应生成沉淀，进一步增强显色的清晰可读性；2.0-10.0mm 8-羟基喹啉、1-20mm硫代硫酸钠与50-300mm磷酸氢二钠能够消除碘分子本底，并使得试纸条在常温干燥条件下能够长时间保质保存。本发明提供的样本释放剂配方中，50-300mm草酸提供适宜ph酸性条件，溶解样本，释放亚硝酸盐，并使之具有氧化性，同时，又能避免酸性过强，避免金属离子获得强氧化性，50-300mm氯化钠提供反应适宜的离子强度，0.5-2mm氯化铁能催化过氧化氢等活性氧物质的快速分解，排除其干扰。