一种附带微型化参比的纳米线pH电极及其制备方法与应用

本发明涉及测试电极，尤其涉及一种附带微型化参比的纳米线ph电极及其制备方法与应用。

背景技术：

1、细胞内h+离子水平(phi)对调节细胞代谢有着重要作用，同时，也是细胞代谢行为的关键指标。因此在单细胞内原位监测ph变化引起了广泛的研究兴趣。目前已建立了多种检测phi的方法，包括比色法、荧光法、表面增强拉曼(sers)以及电化学方法。特别的，以h+离子选择性电极为代表的电化学传感器作为ph测量的主要工具得到了广泛的应用。不过对于细胞内h+离子水平测量，传感器的小型化仍然是必要的，但这依然面临挑战。

2、近年来，单根纳米线电极(nwe)由于其超微小的尺寸和灵活的传感材料，以及高时空分辨率、高灵敏度、插入后细胞损伤小等优点，被广泛应用于胞内安培测量中。目前，微/纳米级ph传感器主要采用h+敏感的导电聚合物或离子载体/聚合物基质共混物，但较差的电导率可能会限制其动态响应性能。如现有技术已基于简便、普适的“一锅法”反应，通过调控核、壳材料种类，基于3,4-乙烯二氧噻吩(edot)与贵金属配合物间的氧化聚合反应，在非导电纳米线表面均匀包裹聚edot(pedot)-贵金属纳米颗粒复合物涂层，批量制备了功能化核壳纳米线；并以此核壳纳米线为电极材料进行组装，可获得具有优良电化学性能的功能化纳米电极，简化了纳米电极的制备过程，并突破了现有纳米电极制备材料的局限性，实现了单个活细胞内生物信号分子的实时定量监测(专利文献1)。

3、相对而言，h+敏感金属氧化物(mox)，如氧化铱(irox)和氧化钌(ruox)，在生化科学、环境监测以及工业应用等领域中吸引了越来越多的关注，在细胞内的ph传感方面具有很高的潜力。由于在mox表面的氧原子位点上能够发生可逆的h+耦合电子转移，并输出ph相关的电极电位。同时，这些mox固有的低电阻率(～60μω·cm)防止了h+结合过程中电极内的电荷滞留，使ph信号快速转导成为可能，此外，可调厚度(nm到μm)为传感器小型化提供了可能，但基于mox电极的胞内ph检测仍尚未见报道。

4、基于单根纳米线电极(nwe)的电化学检测方法可实现胞内各种活性物质的实时监测，然而，对于基于电位检测的测量方法，如ph监测，细胞膜电位会引入干扰。虽然可以通过将参比电极插入胞内形成胞内的局域检测回路以规避此干扰，但目前的胞内参比尺寸常为微米级，且与工作电极分离，需要独立的操作才能将两种电极靠近执行局域ph检测。因此，发展一种简便制备附有微型化参比的纳米ph电极的方法仍有较高需求和更多的有益效果，但目前尚未见报道。

5、现有技术文献

6、专利文献1：cn113152081a

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，在本发明的第一方面，提供了一种可监测胞内或微区ph实时动力学以及实现胞内ph可靠检测的附带微型化参比的纳米线ph电极，其结构包括绝缘外壳、工作部和参比部；工作部、参比部分别由与液态金属连接的工作电极材料、参比电极材料构成；工作部和参比部间由绝缘外壳组装分隔，彼此互不连通；工作电极材料和参比电极材料是以碳化硅(sic)为核心且表面包覆壳层的核壳结构纳米线，其中工作电极材料的壳层为具有ph响应性能的金属氧化物(mox)，参比电极材料的壳层则为银-氯化银复合物(ag/agcl)。工作时，工作部、参比部一端的工作电极和参比电极纳米线同时置于细胞内，另一端分别通过延长的导线与电位检测设备直接相连，向设备输入电位信号，形成完整的检测回路。

2、液态金属采用低熔点的导电金属物质。优选的，所述液态金属包括镓、镓铟合金、镓锡合金、镓铟锡锌合金中的至少一种。

3、优选的，所述金属氧化物包括铱钌双金属氧化物(irruox)、氧化铋、氧化钨、氧化钛、氧化锡中的一种。相比其他金属氧化物，铱钌双金属氧化物(irruox)由于具有极好的导电性，更利于ph信号的快速转导，因此其是十分适合作为工作电极壳层的金属氧化物。

4、纳米线ph电极采用了特定结构的工作电极和参比电极材料，两种电极材料的来源可通过自制的方式生产得到，例如采用水解、沉积的方法将上述金属氧化物附着于碳化硅纳米线表面，形成核壳结构的纳米线；亦可采用通过其他方法制备的具有所述结构的电极材料。

5、进一步优选的，所述金属氧化物为铱钌双金属氧化物(irruox)时，工作电极材料采用如下方法制备而成：将碳化硅纳米线分散于有机溶剂；向所得分散液中加入含水氯化钌和含水氯化铱粉末，混合后进行反应，于碳化硅表面形成包覆层；反应结束后，收集不溶物，经纯化，得到工作电极材料。

6、更进一步的，各原料的添加关系如下：碳化硅纳米线的添加量为1～3mg，含水氯化钌的添加量为6～10mg，含水氯化铱的添加量为7～11mg；有机溶剂包括乙二醇、丙三醇、丙二醇中的至少一种，其添加量为6～9ml。

7、再进一步的，原料添加的铱元素和钌元素采用等物质的量比例。该比例下，所得工作电极材料的纳米尺寸形貌均匀致密，能够提供优秀的导电性和电化学性能。

8、更进一步的，所述反应的温度为180～210℃，反应时间为3～6h。

9、优选的，所述参比电极材料采用如下方法制备而成：将碳化硅纳米线分散于还原性有机溶剂；向所得分散液中加入可溶性银盐和聚合物表面活性剂，混合后进行还原反应，于碳化硅表面形成单质银层；还原反应结束后，收集不溶物，经纯化，得到覆银碳化硅纳米线；覆银碳化硅纳米线经氯化处理，银层被部分氯化为氯化银，形成银-氯化银复合物，处理后经纯化，得到参比电极材料。

10、进一步优选的，各原料的添加关系如下：碳化硅纳米线的添加量为1～3mg，可溶性银盐的添加量为80～120mg，聚合物表面活性剂的添加量为3～6mg，还原性有机溶剂的添加量为4～7ml。

11、进一步优选的，所述可溶性银盐包括硝酸银、氟化银中的至少一种。

12、进一步优选的，所述聚合物表面活性剂包括聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚氧化乙烯(peo)中的至少一种。

13、进一步优选的，所述还原性有机溶剂包括乙二醇、丙三醇、丙二醇中的至少一种。

14、进一步优选的，所述氯化采用的氯化剂包括次氯酸钠、氯化铁、氯化铜中的一种。

15、进一步优选的，所述还原反应的温度为180～210℃，反应时间为6～12h。

16、氯化剂处理可采用以上类型的市售氯化剂溶液，使用前经纯水稀释，例如次氯酸钠溶液采用市售含氯量大于5％的原液，使用时通经过纯水稀释一百倍至0.05％，使用的稀释液体积不限，一般使用5～8ml，将覆银碳化硅纳米线加至次氯酸钠溶液，在室温下摇晃反应3min即可。氯化步骤为本领域常规操作，在氯化剂限定的种类下，本领域技术人员可选择合适的参数完成该操作，无需作特别限定。

17、本发明中，绝缘外壳的作用是分隔工作部和参比部，使其在进行检测时形成完整的检测回路，不发生短路。因此，在满足该设计目的的前提下，绝缘外壳的形制和绝缘材料的选择是多样的，可以根据本领域实际的加工条件及需求进行选择。从原料来源的便利性、成本及稳定性考虑，玻璃材料(例如硼酸盐玻璃、石英玻璃等)是十分适合用于本发明绝缘外壳制备的原料选择。另外，在工业精密加工条件下，可直接通过玻璃完成对工作部和参比部间的绝缘；而在实验室条件下进行制备时，则可采用θ型双通道玻璃管容纳工作部、参比部，并用常温下呈固态，熔点不太高的绝缘物(例如密封蜡等)辅助密封及固定。

18、在本发明的第二方面，提供了一种工艺简便的本发明第一方面的附带微型化参比的纳米线ph电极的制备方法，包括如下步骤：

19、(1)分别将工作电极材料、参比电极材料分散于溶剂，形成相应的分散液；

20、(2)将所得分散液各自滴加至载片表面，待溶剂挥发后刻裁剪载片，使载片边缘暴露工作电极材料或参比电极材料的纳米线；

21、(3)将θ形双通道玻璃管拉至成尖端直径为3～5μm的锥形管；

22、(4)向所得锥形管中两通道分别注入液态金属，将液态金属推送至离锥形管尖端5～10μm处，用密封蜡对尖端进行密封；

23、(5)加热使密封蜡熔化，将工作电极材料、参比电极材料的纳米线分别插入锥形管的液态金属后停止加热，密封蜡凝固完成密封和固定，得到附带微型化参比的纳米线ph电极。

24、为了方便溶剂的快速挥发，溶剂可采用本领域常见的低沸点有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶剂皆是适用于该工艺步骤的类型。

25、该方法呈现的是附带微型化参比的纳米线ph电极在实验室条件下的制备方法。θ形双通道玻璃管的玻璃外壳是圆柱形且直径约为2mm的玻璃毛细管，内部有一层同样材质的玻璃隔层，将圆柱形内腔分割成互不导通的两部分，横截面呈现θ形状。经过如激光拉制仪加热并拉制后得到锥形的毛细管尖端，同样保持θ的截面，灌入液态金属并用绝缘蜡密封后，可以将两种不同功能的导电纳米线分别组装于不同的通道，独立行使相关的功能，用于形成完整的检测回路。电极没有密封的那一端是通过延长的导线与电位检测设备直接相连，向设备输入电位信号。

26、在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面的或采用本发明第二方面方法制备的附带微型化参比的纳米线ph电极的应用，具体是作为测试电极用于监测胞内或微区ph水平及动态变化的应用。

27、本发明首先是为了提供监测胞内ph的快速动力学的电化学检测工具。因为如荧光标记，表面增强拉曼(sers)等方法无法提供快速且准确定量的ph响应能力，电化学方法是最被广泛使用的ph检测手段，但目前有报道的胞内ph检测电极是基于氢离子敏感聚合物膜的，其导电性极差，难以实现胞内ph快速动力学监测；而以氧化铱，氧化钌为代表的金属氧化物(mox)拥有极好的导电性，有利于ph快速变化的实时监测，提供其他方法无法测得的动力学信息，但尚未实现基于氧化铱和氧化钌的胞内ph检测电极。

28、其次，现有的一系列微纳电极基于电流法检测胞内物质，但由于ph检测需要使用电位法监测，如果照旧执行监测过程的话(将参比电极置于胞外，工作电极完全插入胞内)，检测回路将与细胞膜串联，电位法检测将受到细胞膜上不稳定的膜内外电位差干扰，得到的电位检测信号呈现较大波动，无法进行准确可靠的定量。

29、基于以上所述技术方案，本发明的发明构思和原理在于，使用胞内微型化的参比，让工作电极与参比电极同时处于胞内，在同一个细胞内形成完整的检测回路，极大程度减少了膜电位的干扰。以铱钌双金属氧化物(irruox)包覆碳化硅的纳米线为例，工作电极和参比电极的结构具有明显优点。工作电极表面irruox作为高导电氢离子敏感层，其形貌均匀致密，且电化学性能优秀，有利于ph信号的快速转导输出，此电极突破了金属氧化物(mox)难以微型化并用于胞内ph检测的限制。而银-氯化银复合物是电化学中常用的参比电极，在溶液中的电极电位不易受其他物质干扰而改变，有助于保持微区监测的准确和稳定。胞内参比的优势在于，检测过程中排除了细胞膜电位变化对ph检测的干扰，可实现单个活细胞内生理病理状态下ph水平及其动态变化。

30、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

31、本发明提供了一种附带微型化参比的纳米线ph电极，基于金属氧化物的快速ph转导性能提供了监测胞内或微区ph实时动力学的工具，解决了电位法检测胞内ph时易受膜电位变化干扰的问题，实现了胞内ph的可靠检测。

32、本发明提供了一种附带微型化参比的纳米线ph电极的制备方法，该方法简捷易行，突破了电极制备中金属氧化物(mox)难以微型化并用于胞内ph检测的限制。

33、本发明还提供了一种附带微型化参比的纳米线ph电极的应用，作为胞内或微区ph水平及动态变化的检测工具，具有广阔的前景。