本发明涉及蛋白质检测领域，尤其涉及一种采用双重内标定量检测蛋白质的方法。
背景技术：
：：1、随着蛋白质组学的检测技术的进步，越来越多的基于液质联用的绝对蛋白质定量方法（absolute protein quantification）问世，并且广泛应用在食品安全、真伪鉴定、过敏原检测、医学检测等领域。2、基于液质联用的蛋白质绝对定量方法的原理基本上分为3个步骤：3、一、采用加热的方式破坏蛋白质空间结构中的非共价键（主要是氢键、疏水键、范德华力等），同时加入还原剂（通常是二硫苏糖醇或巯基乙醇）破坏维持蛋白质三级、四级结构的二硫键，使蛋白质呈松散的结构，暴露出酶解位点；4、二、加入碱性胰蛋白酶，专一酶解蛋白质序列中的精氨酸（r）和赖氨酸（k）的c端肽键，形成长短不一的水解多肽片段；5、三、以特异性、灵敏度、通用性等原则为基础，为每个蛋白质筛选出一条特异肽，用于定量检测。在完全酶解的前提下，特异肽和蛋白质在摩尔浓度上存在理论换算系数，因此可以通过特异肽的浓度最终计算出蛋白质的浓度，达到绝对定量检测的目的。6、在上述过程中，需要加入同位素内标对预处理过程和质谱离子化过程中的基质效应进行校准。同位素内标稀释法（isotope dilution）在小分子物质检测中已经成为黄金标准，以13c、15n、2h标记的被测物在样本预处理前加入到样本基质中去，不仅能够在提取、净化、富集过程中对被测物的损失进行校准，也能够在质谱离子化过程中对色谱共馏出物导致的离子化效率增益和抑制进行有效校正，提高检测结果的准确度和灵敏度。7、然而，同位素内标稀释法在蛋白质绝对定量研究中受到了极大的挑战，主要原因是在整个检测过程中，蛋白质和多肽两个层面的被测物被引入到检测的反应体系中。如何在这两个层面都能引入同位素内标稀释法，成为研究的热点，也成为了评估检测准确度的关键。8、对于蛋白质检测来说，最完美的内标是同位素标记的蛋白质。因此，有部分学者研发了silac（stable isotope labeling with amino acids in cell culture）技术用于制备同位素标记的蛋白质。简单来说，通过基因工程让宿主细胞表达目标蛋白质，并且让宿主细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中进行培养，最终使其表达的目标蛋白质均带有同位素标记。然而在实际过程中，silac技术依然存在两方面缺陷。首先，最大的缺陷是该技术成本高（每毫克同位素标记的蛋白质高达数万元至数十万元）成为了该技术在实际检测场景中的应用的最大制约因素。其次，silac蛋白质和天然蛋白质在空间结构上有所区别。蛋白质在核糖体内翻译出来后，其翻译后修饰和折叠会异于天然蛋白质。不同的折叠程度会导致蛋白质的松散程度的差异，使胰蛋白酶接触到酶解位点的难易程度产生变化，最终导致silac蛋白质的酶解效率异于天然蛋白质，产生检测结果的偏差。9、为了克服上述的问题，发明人曾尝试过同种异源蛋白质的内标策略在检测牛奶主要蛋白质时，使用了人乳蛋白质作为内标。人乳蛋白质的空间结构于牛奶蛋白质相似，可以有效校正在酶解过程中因酶解效率波动所产生的误差；然而采用同种异源蛋白质策略依然存在不可回避的准确度漏洞：两个同种异源蛋白质的序列必须存在差异，才能够通过液质联用的方式进行检测；而序列上的差异会导致液相色谱行为和质谱离子化效率方面的差异，造成检测结果的偏差。10、部分学者采用化学的方法合成多肽，并且采用同位素标记的氨基酸作为原料，可以制备同位素标记的多肽作为内标。该方法所获得的同位素内标价格远低于silac法，并且可以有效参与质谱的离子化效率校正。然而，该内标多肽不参与酶解和其他前处理过程，无法对前处理过程中的损失、酶解效率变化进行有效校正。11、考虑到化学合成多肽的优势和劣势，有团队尝试在同位素特异肽的基础上，向左右两边按照原有序列各延申若干个氨基酸，称之为延申同位素特异肽（winged isotopicsignature peptide），使其能够参与酶解。然而，由于延申同位素特异肽的序列较短，其结构不会产生折叠等构象，酶解位点完全暴露，酶解效率远高于具有空间折叠的蛋白质。该方法实际上也无法参与校正酶解前处理过程。12、近十年来，不少团队尝试从各个角度优化内标策略，以提高检测结果的准确性，但是现有技术依然存在着各种缺陷，因此，研究蛋白质准确定量检测的内标策略为本领域技术人员亟待解决的问题。技术实现思路1、本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的问题之一。为此，本发明提出了一种采用双内标定量检测蛋白质的方法，可用水溶性蛋白质定量检测，适用于食品检测领域及医学检验领域。在整个检测过程中，为每种被测的目标蛋白质引入了2种类型的内标，即一个内标蛋白质和两个同位素标记多肽内标。2、内标蛋白质选自天然结构或者功能与目标蛋白质相似的蛋白质，可用于校正酶解效率上的差异及校准在预处理中亲和富集效率的差异。3、目标蛋白质和内标蛋白质在酶解后会形成各自的特异肽。由于其理化性质的细微差别，会导致其在质谱检测中受到的基质增益/抑制产生差异。因此，本发明在酶解液中为目标蛋白质和内标蛋白质分别加入各自同位素标记的特异性多肽作为内标。通常同位素标记位点通常将12c、14n或1h替换成13c、15n或2h。同位素多肽与特异肽具有相同的理化性质，可以校正在质谱检测中的基质增益/抑制。4、具体的本发明采用的技术方案是：5、一、样本预处理；6、二、采用液相色谱串联质谱法同时对被测的目标蛋白质特异肽、内标蛋白特异肽、2个内标蛋白同位素特异肽进行检测；7、三、在一个样品中，每个被测物都会产生4个峰面积参数，“峰面积比的比值”（ratio of ratio of peak area, r2pa）将4个峰面积参数归结到1个参数，并且以r2pa为纵坐标，样本浓度为横坐标，建立回归方程，计算样品浓度，用以下公式计算“峰面积比的比值”，8、9、四、以校准品的“峰面积比的比值”与校准品浓度建立校准曲线；将样本的“峰面积比的比值”代入校准曲线中计算样本浓度。10、所述样本预处理包括如下步骤：11、（1）将蛋白质溶解，12、（2）加入内标蛋白，13、（3）蛋白质的酶解，14、（4）中止酶解，15、（5）加入2个同位素多肽内标。16、所述酶解中的蛋白酶可选自碱性胰蛋白酶、胃蛋白酶和v8蛋白酶中的一种，或其他常规蛋白质酶。17、所述终止酶解可选用加酸、加热中的一种，或其他常规破坏蛋白酶活性的方式。18、优选地，所述步骤（2）和步骤（3）之间还可以包括蛋白质富集、净化步骤，所述蛋白质富集、净化可采用和吸附、沉淀、超滤、分子体积排阻等常规蛋白质纯化富集手段。19、优选的，所述步骤（2）和步骤（3）之间还可以包括蛋白质变性步骤，所述蛋白质变性可采用加热、加入表面活性剂等常规方式进行处理。20、优选地，所述内标蛋白质加入时机为蛋白质酶解之前。21、优选地，所述同位素标记多肽内标加入时机在蛋白质酶解完成后。22、优选的，所述2个内标蛋白同位素特异肽的序列分别与目标蛋白特异肽和内标蛋白特异肽相同，且将其中的一个或者几个氨基酸替换成同位素标记的氨基酸。23、优选的，所述内标蛋白质特异肽选自天然结构或者功能与目标蛋白质相似的蛋白质。24、优选的，所述目标蛋白质特异肽和内标蛋白质特异肽选自酶解条件接近的多肽。25、有益效果：26、1、与同位素标记特异肽的内标相比，本发明加入了蛋白质层面的内标，能够参与和校准蛋白质预处理（例如富集、酶解）过程中的效率差异；27、2、与蛋白质类似物的内标相比，本发明额外为目标蛋白和内标蛋白各添加一条多肽，能够校准目标蛋白质特异肽和内标蛋白质特异肽在质谱检测过程中的基质增益/抑制。28、3、与最现金的silac技术相比，本发明使用天然蛋白质而非基因工程表达的蛋白质作为内标。一方面降低了成本，通常基因工程表达的同位素蛋白质价格在每毫克数十万，而天然蛋白质成本能够数千倍地降低。另一方面，天然蛋白质具有天然构象，优于基因工程表达的蛋白质。当前第1页12当前第1页12