液相色谱电化学法高通量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法与流程

本发明涉及分析检测，尤其涉及液相色谱电化学法高通量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法。

背景技术：

1、儿茶酚胺（catecholamine，ca）类物质主要包括肾上腺素（epinephrine，e）、去甲肾上腺素（norepinephrine，ne）和多巴胺（dopamine，da）。ca是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，是具有较强的生理学活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。检测生物样本中的儿茶酚胺及其代谢物水平不仅对于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义，并且有助于甲状腺功能异常、充血性心力衰竭、糖尿病、肾脏功能不全等疾病的诊断。同时，对于神经电生理等基础医学研究也具有重要的意义。

2、儿茶酚胺的代谢物主要包含变肾上腺素(metanphrine，mn)、去甲变肾上腺素（normetanephrine, nmn）、3-甲氧基酪胺（3-methoxytyramine，3-mt）、香草扁桃酸（vanillylmandelic acid，vma）和高香草酸（homovanillic acid，hva）。nmn及mn分别是ne和e的中间代谢产物（合称mns），其仅在肾上腺髓质嗜铬细胞或ppgl肿瘤体内代谢生成，并且以高浓度水平持续存在；mns的半衰期较ca长，也更加稳定。vma是e、ne的主要终末代谢产物。嗜铬细胞瘤患者能够分泌大量的肾上腺素和去甲肾上腺素，其中大约60％将最终转化为 vma，随尿液排出体外。hva与vma结构相似，是体内单胺类神经递质多巴胺的终末代谢产物。

3、嗜铬细胞瘤( pheochromocytoma, pcc) 起源于肾上腺髓质嗜铬细胞，分泌产生儿茶酚胺；副神经节瘤( paraganglioma, pgl)起源于肾上腺外嗜铬细胞，位于胸、腹和盆腔脊柱旁交感神经链，也可来源于沿颈部和颅底分布的舌咽、迷走神经的副交感神经节，后者常不产生ca。pcc 占 80% ~ 85%，pgl 占 15% ~ 20% ，二者总称ppgls（pheochromocytomas or paragangliomas），是继发性高血压的少见类型，在普通门诊高血压患者中的患病率为0.2%~0.6%。神经母细胞瘤患者体内可同时分泌过量的肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺，其代谢产物vma和hva通过肾脏排泄，在疾病早期即可升高。同时检测尿vma、hva不仅可以间接反映体内儿茶酚胺的排泌情况，而且对嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等中枢神经系统疾病的早期辅助诊断及鉴别具有重要的意义。

4、目前，临床上关于儿茶酚胺及其代谢物的检测方法主要包括液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光光度法等。由中华医学会内分泌学分会肾上腺学组在中华内分泌代谢杂志发表的《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》中提出，首先推荐液相色谱-质谱法（lc-ms/ms）测定儿茶酚胺及其代谢物。液相色谱-质谱法具有非常高的灵敏度，特异性和准确度，但是lc-ms/ms法复杂的设备操作对操作人员有更高的要求，昂贵的设备及维护成本需要更大的资金投入。除此之外，共识中还推荐液相色谱电化学法（hplc-ecd）测定儿茶酚胺及其代谢物，相比质谱仪，电化学检测器成本更低，操作简单。

5、现有技术cn 106610405 a公开了一种先固相萃取然后采用高效液相色谱电化学法检测人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物的方法，但是其仅能检测甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素四种物质，且色谱检测时间较长。李炳源等人在《高效液相色谱电化学检测生物样品中儿茶酚胺的研究》中也提供了一种检测方法，其也仅能检测少量的几种儿茶酚胺物质，不适用儿茶酚胺代谢物的同时检测，且色谱检测时间较长。

6、因此，如何在较短的时间内同时检测多种儿茶酚胺及其代谢物，降低检测成本，简化操作，同时又能保证检测方法的灵敏度、特异性和准确度，是目前亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、为解决上述技术难题，特提出本发明。

2、首先，本发明提供了一种液相色谱电化学法高通量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，包括：

3、将待测样品经wcx固相萃取后，采用液相色谱联合电化学检测器进行检测；

4、所述液相色谱的条件包括：

5、c18色谱柱；

6、流动相a：柠檬酸、磷酸二氢钾、正己烷磺酸钠和乙二胺四乙酸二钾盐的水溶液；

7、流动相b：甲醇；

8、洗脱过程中流动相a和流动相b的体积百分比之和为100%；

9、洗脱程序采用等度洗脱，流动相a的体积百分比为80%~85%；

10、所述儿茶酚胺及其代谢物为多巴胺（da）、肾上腺素（e）、去甲肾上腺素（ne）、去甲变肾上腺素（nmn）、变肾上腺素（mn）、3-甲氧基酪胺（3-mt）中的至少一种。

11、本发明通过对各项检测条件的组合大量摸索优化后发现，将待测样品经wcx固相萃取后，采用上述液相色谱检测条件联合电化学检测器检测后，能够实现快速同时对多种儿茶酚胺及其代谢物的高灵敏度、高特异性和高准确度的检测，大幅降低检测成本，简化操作。

12、在上述检测方案中，所述液相色谱的检测时间为15min以内。

13、在一些实施方案中，所述待测样品为尿液。

14、优选地，流动相a的体积百分比为82%~83%。

15、本发明进一步经过实验探究后发现，控制流动相a的体积百分比为82%~83%进行等度洗脱，能够使得液相色谱的检测时间在12min以内实现对多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺的同时检测。

16、优选地，所述液相色谱的检测时间为10min以内。

17、优选地，电化学检测器的检测电压为800v~1200v。

18、优选地，电化学检测器的检测电压为1000v~1200v。

19、优选地，电化学检测器的检测电压为1050v~1150v。

20、本发明进一步经过实验探究后发现，在1050v~1150v检测电压时，多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺这6种儿茶酚胺及其代谢物的电化学信号均较强。

21、优选地，所述c18色谱柱的规格为3μm，4.6150mm。

22、优选地，流动相a为10~20mm柠檬酸、30~40mm磷酸二氢钾、3~5mm正己烷磺酸钠以及0.05~0.2mg/ml乙二胺四乙酸二钾盐二水合物的水溶液。

23、更优选地，流动相a为12~18mm柠檬酸、32~38mm磷酸二氢钾、3~4mm正己烷磺酸钠以及0.05~0.15mg/ml乙二胺四乙酸二钾盐二水合物的水溶液。

24、优选地，所述液相色谱的条件还包括：流速为0.5~1.5 ml/min；和/或，柱温为35~45℃；和/或，进样量为20~40μl。

25、优选地，所述固相萃取的步骤包括：

26、将待测样品与乙酸铵溶液混合，然后经wcx固相萃取，采用乙酸铵溶液和甲醇分别淋洗，而后采用乙腈和甲酸的水溶液洗脱。

27、优选地，所述固相萃取的步骤还包括：洗脱后的洗脱液经氮吹吹干，用盐酸和甲醇的水溶液复溶后，采用液相色谱联合电化学检测器进行检测。

28、采用上述固相萃取的方式制备的待检液，联合上述液相色谱条件分离之后，采用电化学检测器检测时，6种儿茶酚胺及其代谢物的灵敏度、特异性和准确度更佳。

29、优选地，所述检测方法还包括：采用外标法进行定量检测。

30、优选地，所述液相色谱为高效液相色谱。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

32、本发明提供了一种利用高效液相色谱电化学法高通量同时检测多种儿茶酚胺及其代谢物的方法，该检测方法能够满足6种儿茶酚胺及其代谢物的线性、准确度、精密度、残留和回收率的检测要求，相比质谱检测方法，大幅降低了检测成本，简化操作，方便，快速，同时又能保证检测方法的灵敏度、特异性和准确度，对监测儿茶酚胺及其代谢物具有重要意义。