检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用的制作方法

本发明涉及医学诊断，尤其涉及一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用。

背景技术：

1、莱顿第五因子(factor v leiden)突变比率很高，因为莱顿第五因子异常，无法阻断凝血功能，使凝血异常而形成栓塞。即莱顿第五因子缺乏症，又称为遗传性凝血因子ⅴ缺乏症(factor v deficiency，mim 227400)。本病系常染色体隐性遗传，发病率约1/100万。少数患者父母为近亲婚配。部分患者可合并其他先天性异常，如输尿管畸形、动脉导管未闭等。临床上，该缺陷症约25％的患者有出血表现，主要有皮肤瘀斑、鼻出血和月经过多、产后出血等，发生在胃肠道及中枢神经系统可危及生命的出血比较罕见。该缺陷症患者的出血严重性与ⅴ凝血因子促酶活性水平没有一致性，杂合子型凝血因子ⅴ缺陷症病例往往无明显的临床出血症状，多数纯合子型病例的临床出血症状较轻；部分患者有静脉血栓形成事件。

2、其中f5基因(mim 612309)基因突变会导致常染色体隐性遗传疾病莱顿第五因子缺乏症(mim 227400)；f5基因定位于染色体1q24.2，包括25个外显子和24个内含子，基因长74.5kb，开放读码框6675bp，编码2225个氨基酸序列的蛋白f5(凝血因子ⅴ)。

3、凝血因子ⅴ由肝脏合成，半衰期为12～36小时。在生理条件下，它具有促凝、抗凝双重作用。在凝血过程中，其活化形式与钙离子、磷脂和凝血酶原复合物是凝血酶原最主要的激活物，是凝血过程中十分重要的辅因子。另外，c反应蛋白(蛋白c)可将凝血因子ⅴ水解为具有抗凝活性而缺乏促凝活性的分子，后者可作为蛋白c的辅因子，在蛋白s的协同作用下，灭活ⅷ凝血因子促酶活性等凝血因子，参与抗凝。因此，凝血因子ⅴ基因缺陷可能导致出血或血栓，形成两种完全相反的表现类型。

4、因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊莱顿第五因子缺乏症的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。现有技术中对基因突变位点的基因型进行检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用，以解决莱顿第五因子缺乏症的筛查和诊断的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种f5基因突变体，f5基因突变体相较于野生型f5基因，所述野生型f5基因的第13号外显子的第2393位碱基c缺失。

3、本发明还提供了一种f5突变体蛋白，f5突变体蛋白相较于野生型f5基因编码的蛋白，第798位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。

4、本发明还提供了一种上述的f5基因突变体或上述的f5突变体蛋白作为检测靶点在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂和/或制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒中的应用。

5、本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的扩增引物，扩增引物包括上游引物f5-1f和下游引物f5-1r；上游引物f5-1f包括如seq id no.1所示的核苷酸序列，下游引物f5-1r包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。

6、本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的测序引物，测序引物包括上游引物f5-seq1f和下游引物f5-seq1r；上游引物f5-seq1f包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；下游引物f5-seq1r包括如seq id no.4所示的核苷酸序列。

7、本发明还提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物组合，包括上述的扩增引物和/或上述的测序引物。

8、本发明还提供了一种如上述的引物组合在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂中的应用。

9、根据本申请的实施方式，莱顿第五因子缺乏症的检测靶点包括f5基因突变体；f5基因突变体相较于野生型f5基因，所述野生型f5基因的第13号外显子的第2393位碱基c缺失。

10、本发明还提供了一种莱顿第五因子缺乏症检测试剂，莱顿第五因子缺乏症检测试剂包括上述的引物组合。

11、本发明还提供了一种上述的莱顿第五因子缺乏症检测试剂在莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒及其制备中的应用。

12、本发明的有益效果至少包括：

13、本发明提供了一种f5基因突变体，其相较于野生型f5基因，所述野生型f5基因的第13号外显子的第2393位碱基c缺失。并且，本发明发现该f5基因突变体可以导致莱顿第五因子缺乏症。

14、本发明提供的f5基因突变体丰富了莱顿第五因子缺乏症的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述f5基因突变体，能够筛查或诊断莱顿第五因子缺乏症的致病基因突变携带者或患者，用于莱顿第五因子缺乏症的遗传学诊断，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为莱顿第五因子缺乏症患者的治疗提供全新的理论依据，为治疗莱顿第五因子缺乏症提供可能的药物靶点。

技术特征：

1.一种f5基因突变体，其特征在于，所述f5基因突变体相较于野生型f5基因，所述野生型f5基因的第13号外显子的第2393位碱基c缺失。

2.一种f5突变体蛋白，其特征在于，所述f5突变体蛋白相较于野生型f5基因编码的蛋白，第798位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。

3.一种如权利要求1所述的f5基因突变体或如权利要求2所述的f5突变体蛋白作为检测靶点在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂和/或制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒中的应用。

4.一种检测莱顿第五因子缺乏症的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括上游引物f5-1f和下游引物f5-1r；所述上游引物f5-1f包括如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述下游引物f5-1r包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。

5.一种检测莱顿第五因子缺乏症的测序引物，其特征在于，所述测序引物包括上游引物f5-seq1f和下游引物f5-seq1r；所述上游引物f5-seq1f包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；所述下游引物f5-seq1r包括如seq id no.4所示的核苷酸序列。

6.一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物组合，其特征在于，包括如权利要求4所述的扩增引物和/或如权利要求5所述的测序引物。

7.一种如权利要求6所述的引物组合在制备莱顿第五因子缺乏症检测试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述莱顿第五因子缺乏症的检测靶点包括f5基因突变体；所述f5基因突变体相较于野生型f5基因，所述野生型f5基因的第13号外显子的第2393位碱基c缺失。

9.一种莱顿第五因子缺乏症检测试剂，其特征在于，所述莱顿第五因子缺乏症检测试剂包括如权利要求6所述的引物组合。

10.一种如权利要求9所述的莱顿第五因子缺乏症检测试剂在莱顿第五因子缺乏症检测试剂盒及其制备中的应用。

技术总结
本发明提供了一种检测莱顿第五因子缺乏症的引物、基因突变体、突变体蛋白、试剂及应用；其中，所述F5基因突变体相较于野生型F5基因，所述野生型F5基因的第13号外显子的第2393位碱基C缺失。本发明提供的基因突变体能够用于筛查或诊断莱顿第五因子缺乏症的致病基因突变携带者或患者，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为莱顿第五因子缺乏症患者的治疗提供全新的理论依据。

技术研发人员：曾桥,刘亚宁,范园,何亮波,刘鑫林
受保护的技术使用者：湖南家辉生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/8