调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法

本发明属于花青素检测，尤其涉及一种调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法。

背景技术：

1、目前，植物在光下，特别是短波光下可以积累花青素，这对植物抵抗逆境胁迫具有重要作用；另外花青素还能赋予许多水果、蔬菜、花卉等有更多不同的颜色，增加经济效益。解析植物花青素合成调控机制，对于改良果蔬等经济作物品质具有重要的指导价值，因此，作为植物遗传、性状研究的模式植物，十字花科拟南芥的花青素积累调控机制的解析在研究果蔬等作物的花青素合成调控具有重要的参考意义。

2、目前对于改良植物花青素积累的方法有一些报道，如通过施加催熟剂乙烯利促进果实成熟，从而促进果实花青素的积累；通过施加草酸来增加桃果实的花青素含量等。但乙烯利、草酸等一些化合物过量施加有危害人们的风险，特别是草酸有较强的腐蚀性，喷施过程中对喷施者有一定的风险性。另外有其他研究者发现使用1-氨基环丙烷羧酸(简称acc)代替乙烯利调控果实的成熟与着色，但acc施加需要特别注意浓度控制，否则导致黄叶、干叶等不利于植株生长的症状。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术使用的乙烯利、草酸等一些化合物过量施加有危害人们的风险，特别是草酸有较强的腐蚀性，喷施过程中对喷施者有一定的风险性；使用1-氨基环丙烷羧酸易导致黄叶、干叶等不利于植株生长的症状。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法。

2、本发明是这样实现的：通过将拟南芥种子播种于有或无褪黑素的1/2ms培养基上，春化三天后使用较强白光照射以促进萌发，然后置于蓝光条件下生长两天，在含有褪黑素的培养基生长的拟南芥幼苗表现出与对照相比更少的花青素积累。

3、一种调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法，包括以下步骤：

4、第一步，将拟南芥种子使用10％naclo溶液消毒；

5、第二步，使用无菌水清洗3～4次；

6、第三步，播种于含有或无褪黑素的1/2ms培养基中春化3d置于蓝光条件下生长两天，发现褪黑素可有效降低蓝光诱导的拟南芥幼苗花青素积累量。

7、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法将野生型拟南芥种子col-0使用10％naclo溶液消毒后，使用无菌水清洗3～4次，播种于含有50μmol/l褪黑素的1/2ms固体培养基上，以加入等量75％甲醇的1/2ms培养基中生长的拟南芥为对照，每种处理三皿，每皿播100粒种子；播种后于4℃避光春化3d，转移至100～150μmol/m2/s的白光下照光6h，以促进同步萌发；然后置于蓝光40μmol/m2/s条件下生长2d，观察到在含有50μmol/l的褪黑素培养基中生长的拟南芥幼苗花青素积累明显降低。

8、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法的褪黑素溶液配制方法：称取0.232g褪黑素粉末，在20ml 75％甲醇溶液中彻底溶解，此时褪黑素溶液浓度为50mmol/l；根据需要的褪黑素溶液浓度进行稀释于1/2ms培养基中。

9、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法的1/2ms培养基的配置：

10、ms培养基(不含蔗糖和琼脂)，500ml加入量1.185g；

11、蔗糖，500ml加入量5g；

12、mes，500ml加入量0.25g；

13、琼脂，500ml加入量4.0g；

14、药品溶解后，并调节ph值到5.7～5.8，最后加入琼脂，进行高压蒸汽灭菌。

15、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法的花青素含量测定方法：将蓝光条件或黑暗条件下生长的拟南芥幼苗从1/2ms培养基上取出，相同生长时间的拟南芥取相同株数，浸泡于600μl含有1％hcl v/v的甲醇溶液中，置于4℃，避光浸泡过夜；然后加入400μl超纯水和400μl三氯甲烷，混匀后于12000rpm，离心2～3min，取200μl上清液加入96孔透明酶标板中，以同样处理但未浸泡过植物的上清液作为空白对照。

16、进一步，使用酶标仪在530nm和657nm波长下测定吸光度；按照公式即花青素含量＝a530-0.25×a657对花青素积累量进行定量。

17、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法的基因表达分析使用实时荧光定量pcr的方法检测花青素合成相关基因表达水平是否受褪黑素处理的影响，将所需检测的拟南芥种子播种于1/2ms培养基上，每皿200粒。

18、进一步，将播种后的种子于黑暗条件下，4℃春化3d；转移至100～150μmol/m2/s的白光下照射6h；转移至40μmol/m2/s的持续蓝光下生长44h；每两皿的拟南芥幼苗取一个样品，分别浸泡于含有等量甲醇、150μm的褪黑素的1/2ms液体培养基中，浸泡4h，取出吸掉表面水分，置于液氮中或-80℃保存。

19、进一步，提取rna，并反转录获得cdna，根据试剂盒说明书，每个样品反转录1μg。

20、进一步，所述调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法的实时荧光定量pcr引物：

21、引物名称actin2-f序列attacccgatgggcaagtca；

22、引物名称actin2-r序列cacaaacgagggctggaaca；

23、引物名称f3’h-f序列ccctttccgccatggttact；

24、引物名称f3’h-r序列ctagcgaaattggcgtcgtg；

25、引物名称dfr-f序列aaacgccaagacgctactca；

26、引物名称dfr-r序列cacgtggaaaacaccgtcac；

27、引物名称ugt79b3-f序列gatgaaaagggacagcgagc；

28、引物名称ugt79b3-r序列cgaaagcatcgacataaccagt。

29、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

30、第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：本发明具体提供一种调控拟南芥花青素含量的方法，将拟南芥种子使用10％naclo溶液消毒后，使用无菌水清洗3～4次，播种于含有或无褪黑素的1/2ms培养基中春化3d置于蓝光条件下生长2d，发现褪黑素可有效降低蓝光诱导的拟南芥幼苗花青素积累量。

31、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：本发明利用低浓度的褪黑素处理拟南芥，可以调控蓝光诱导的拟南芥幼苗花青素的积累量，对褪黑素在调控果蔬、花卉等作物花青素含量，获得更加优良的性状的研究中具有重要的指导意义。另外，本发明将褪黑素这种植物新型激素应用于植物花青素调控方面，补充了褪黑素在植物体发挥的功能，为进一步研究褪黑素在植物体内发挥的功能提供新的思路。

32、第三，本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

33、自1947年，法国波尔多大学(university ofbordeaux)在读博士生马斯魁勒在花生仁包衣中发现花青素以来，人们对于花青素的种类以及功能逐渐清晰。而通过研究花青素的生物合成调控，改良植物的着色，对于经济作物的种植与改良，以及新品种的获得，有着重要的指导作用；花青素积累是植物光形态建成的表现之一，研究花青素积累的调控机制对于研究植物体光形态建成过程的调控机制具有新的指导意义；将花青素添加于日常的食品甚至药品中，不仅增加食品的营养价值，还可以有效地预防和治疗许多疾病，因此研究花青素合成调控机制是必要的。本发明将褪黑素与蓝光信号诱导的花青素之间的关系联系起来，为进一步研究花青素的蓝光诱导机制与褪黑素抑制花青素合成机制提供新的研究思路。

34、本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

35、褪黑素首先在动物体中发现，并发现在调控动物的生物节律有着重要的作用。在植物体内的发现与研究始于1994年，首先在牵牛花中发现褪黑素的存在。在植物体内，褪黑素在应对生物和非生物胁迫、参与植物免疫，以及调控植物节律有了重要的研究进展。本发明的第二点价值在于褪黑素在植物体中功能有了进一步的拓展，补充了褪黑素在植物体中调控植物着色的功能。

36、第四，本发明提出了一种调控十字花科植物拟南芥花青素含量的方法，这种方法特别针对了如何有效调节植物体内的花青素含量，这对于植物生物学研究以及农业应用都具有重要意义。以下是本发明的详细分析，包括其解决的技术问题、技术方案及取得的显著技术进步：

37、解决的技术问题：在现有技术中，调控植物体内花青素含量的方法受限，本发明通过特定的培养条件和褪黑素的应用，有效调节拟南芥中的花青素含量。传统方法在处理花青素含量时较为复杂和耗时，本发明提供了一种更为简单高效的实验步骤。通过精确的花青素含量测定方法，本发明提高了实验结果的可靠性和精度。

38、技术方案：拟南芥种子经过naclo消毒和无菌水清洗后，在含有或不含褪黑素的1/2ms培养基中进行播种和培养。在1/2ms培养基中加入特定浓度的褪黑素，调节幼苗的花青素积累。通过特定的化学方法定量测定植物体内的花青素含量。使用实时荧光定量pcr方法检测花青素合成相关基因的表达水平。

39、显著的技术进步：

40、1)有效调节花青素含量：本发明能够有效地降低蓝光条件下拟南芥幼苗的花青素积累，提供了一种新的调控植物体内花青素含量的方法。

41、2)提高实验效率：通过简化的种子处理和播种方法，以及直接在培养基中添加褪黑素，本发明提高了实验的效率。

42、3)提升结果精度：采用精确的花青素含量测定方法和基因表达分析技术，本发明提高了实验结果的准确性和可靠性。

43、4)扩大研究应用范围：该方法不仅适用于基础生物学研究，还可应用于农业生产中的品种改良和品质控制。

44、本发明提供了一种在实验室条件下高效、准确调控十字花科植物拟南芥花青素含量的新方法，不仅在生物技术领域具有重要的应用价值，也为植物生理学和遗传学的研究提供了重要工具。