一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法。

背景技术：

1、生物体遭受逆境胁迫时会产生大量的超氧自由基，使膜脂质发生过氧化反应，产生丙二醛(malondialdehyde，mda)，mda的过量积累会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，导致细胞膜的结构和功能发生改变，因此，膜脂质过氧化反应是生物体细胞膜受损的一个重要标志，通常用膜脂质过氧化产物即mda来表征和测量细胞质膜过氧化水平。此外，在生理条件下，各种蛋白质与mda的相互作用已被证明会产生各种潜在的毒性加合物，并引起蛋白质的交联。当mda和mda-蛋白加合物在细胞和组织中作为应激氧化过程的内源性产生时，它们被认为是许多人类疾病的潜在致病因子，如不同类型的癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病和衰老。

2、目前，mda的检测方法有荧光法、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱(gc)和硫代巴比妥酸(tba)法。荧光法容易受到多种散射光的干扰，如溶剂的瑞利散射光、容器表面的散射光、胶粒的散射光及溶剂的拉曼光等，这对荧光光谱造成显著影响，导致检测灵敏度和准确度效果大打折扣。高效液相色谱法(hplc)和气相色谱(gc)操作复杂，对检测人员专业要求高、仪器成本大，一般实验室通常较难开展。所以关于mda的检测运用最多的是tba法。硫代巴比妥酸(tba)法操作简单，在95℃高温和低ph等条件下mda能与tba反应，生成较稳定的红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮)复合物。其最大吸收波长在532nm，因此可用紫外分光光度法测定。tba法重复性较好，无需昂贵仪器，适于一般实验室使用，但传统的tba法在生物样品(包括组织裂解液、血液、血清、血浆、精液、精浆等)加热后会产生的很多蛋白沉淀，蛋白沉淀对mda与tba的红色反应复合物具有吸附作用，导致测量结果产生偏差，同时也不利于上清液的分离抽取。并且传统的tba法只能检测游离态的mda，而更能反映细胞毒性的与蛋白结合的结合态mda通常难以被检测，故通常需要较多的样品量进行显色反应，而缺乏对微量样品检测的高灵敏度。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，以消除蛋白沉淀的吸附干扰，同时检测与蛋白结合态的mda、实现对生物样品mda的准确和微量检测的目的。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，包括以下步骤：

3、s1：向丙二醛标准溶液中加入缓冲液和蛋白酶溶液，在50-60℃下孵育10-30min，随后加入tba试剂，密封后于90-110℃下反应20-40min，最后测定丙二醛标准溶液在532nm处的吸光度a1；

4、s2：以丙二醛标准溶液的浓度c1为横坐标、吸光度a1为纵坐标进行线性拟合，构建标准曲线y＝ax+b，其中a、b为常数；

5、s3：制备生物样品溶液；

6、s4：用等体积的生物样品溶液代替步骤s1中的丙二醛标准溶液，加入缓冲液和蛋白酶溶液后在相同条件下孵育-反应，然后测得生物样品溶液在532nm处的吸光度a2，最后根据步骤s2得到的标准曲线，计算得到生物样品溶液中丙二醛的浓度c2；

7、s5：经过计算得到生物样品中丙二醛的实际浓度c实际值，计算公式如下：

8、

9、式中，a空白值为去离子水在在532nm处的吸光度。

10、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

11、进一步，缓冲液为buffer a缓冲液。

12、进一步，buffer a缓冲液由0.5-1wt％tritonx-100、0.8-1.2wt％脱氧胆酸钠和0.05-0.15wt％sds组成，余量为水。

13、进一步，蛋白酶溶液为蛋白酶k、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶溶液。

14、进一步，蛋白酶溶液的浓度为0.015-0.02g/ml。

15、进一步，tba试剂的配置步骤为：将tba、三氯乙酸和edta以0.1-2：7.5-9.5：0.1-0.2的质量比溶于水中，即得。

16、进一步，tba试剂的浓度为0.01-0.05mol/l。

17、进一步，丙二醛标准溶液、缓冲液、蛋白酶溶液和tba试剂的体积比为10-15：10-15：1-5：1-10。

18、进一步，生物样品为组织裂解液、血液、血清、血浆、精液或精浆。

19、进一步，生物样品溶液的质量分数为10-20％。

20、本发明的有益效果为：本发明方法样品处理过程简单，使用的buffer a缓冲液和蛋白酶可以使得与蛋白质结合的mda释放，不仅可以避免蛋白沉淀对mda与tba的红色复合物的吸附干扰和上清抽取限制，也可以检测到蛋白质结合态的mda，能显著提高样品的检测限，选择性好，提高了检测结果的准确性，还可以用于临床珍贵样品的微量检测。

技术特征：

1.一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述缓冲液为buffer a缓冲液。

3.根据权利要求2所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述buffer a缓冲液由0.5-1wt％tritonx-100、0.8-1.2wt％脱氧胆酸钠和0.05-0.15wt％sds组成，余量为水。

4.根据权利要求1所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述蛋白酶溶液为蛋白酶k、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶溶液。

5.根据权利要求4所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述蛋白酶溶液的浓度为0.015-0.02g/ml。

6.根据权利要求1所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于，所述tba试剂的配置步骤为：将tba、三氯乙酸和edta以0.1-2：7.5-9.5：0.1-0.2的质量比溶于水中，即得。

7.根据权利要求6所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述tba试剂的浓度为0.01-0.05mol/l。

8.根据权利要求1所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述丙二醛标准溶液、缓冲液、蛋白酶溶液和tba试剂的体积比为10-15：10-15：1-5：1-10。

9.根据权利要求1所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述生物样品为组织裂解液、血液、血清、血浆、精液或精浆。

10.根据权利要求9所述的提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，其特征在于：所述生物样品溶液的质量分数为10-20％。

技术总结
本发明公开了一种提高生物样品中丙二醛含量测定准确性的方法，包括向丙二醛标准溶液中加入缓冲液、蛋白酶溶液和硫代巴比妥酸(TBA)，测定丙二醛标准溶液的吸光度；随后构建标准曲线，通过测得的生物样品溶液的吸光度计算得到生物样品中丙二醛的实际浓度。本发明方法样品处理过程简单，使用的Buffer A缓冲液和蛋白酶可以使得与蛋白质结合的MDA释放，不仅可以避免蛋白沉淀对MDA与TBA的红色复合物的吸附干扰和上清抽取限制，也可以检测到蛋白质结合态的MDA，能显著提高样品的检测限，选择性好，提高了检测结果的准确性，还可以用于临床珍贵样品的微量检测。

技术研发人员：田美平,李慧茹,黄清育
受保护的技术使用者：中国科学院城市环境研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12