快速检测发酵液中有机酸含量的方法与流程

本申请涉及检测，尤其涉及一种快速检测发酵液中有机酸含量的方法。

背景技术：

1、常见的有机酸检测方法有：气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液质联用法。

2、使用气相色谱法和气质联用法检测需要进行样品前处理，操作复杂，高温检测，仪器平衡时间长。如专利“一种酵素中有机酸的快速检测方法”，样品前处理需经过离心、甲酯化、萃取、过滤等过程，其中甲酯化通常需要1-2h，大大增加了检测时长，仪器四极杆温度可达280℃，增加了仪器的平衡时间。

3、高效液相色谱法(hplc)因为分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高的优点而被广泛应用。然而，现有技术中使用hplc法测定发酵液中有有机酸时存在分离物质种类少、检测时间长、流动相配置复杂等缺陷。如专利“一种用hplc测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法”，仅检测了6种有机酸；专利“一种酵素中有机酸的快速检测方法”，检测时长为26分钟，只检测出7种有机酸；专利“木瓜发酵饮料中有机酸含量的检测方法”中流动性相为磷酸盐缓冲缓冲溶液，对仪器要求高，容易造成管道和色谱柱的堵塞。

4、液质联用成本相对较高，混合物样品中共存物质的干扰会抑制分析物的离子化，降低灵敏度。如专利“一种基于液质联用的食品中有机酸检测方法”，样品前处理复杂，离子传输温度可达500℃，对仪器要求较高，且易因人为因素(仪器平衡不充分、前处理操作误差等)引起不必要的损失。

5、针对现有技术检测有机酸时存在的检测种类少、样品处理繁琐、流动相配置操作复杂等问题。本领域亟需一种检测种类多、检测方法简便的hplc方法。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种快速检测发酵液中有机酸含量的方法，以解决上述问题。

2、为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：

3、一种快速检测发酵液中有机酸含量的方法，包括：

4、称取奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸、丁酸标准品，用去离子水配制成所需浓度的标准品混合溶液；

5、在第一条件下使用所述标准品混合溶液和空白样进行高效液相色谱检测，以标准品的溶液浓度为横坐标，以标准品的峰面积为纵坐标，分别绘制奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸、丁酸的标准曲线；

6、在第二条件下使用所述发酵液为待测样进行高效液相色谱检测，得到发酵液中有机酸的hplc图谱；

7、使用外标法计算所述待测样中奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸、丁酸的含量；

8、所述第一条件和所述第二条件包括：以反相色谱柱为固定相、酸性水溶液和有机溶液作为流动相，检测波长为210nm。

9、优选地，所述标准品混合溶液中，标准品的浓度范围为：奎宁酸0.1-1.5mg/ml、苹果酸0.1-1.3mg/ml、乳酸0.1-1.2mg/ml、乙酸0.3-4.2mg/ml、柠檬酸0.1-1.0mg/ml、琥珀酸0.2-2.0mg/ml、富马酸0.003-0.03mg/ml、丙酸0.0003-0.003mg/ml和丁酸0.0006-0.006mg/ml。

10、优选地，所述反相色谱柱包括c18色谱柱、c8色谱柱或c4色谱柱。

11、优选地，所述反相色谱柱的粒径为2.6μm、3μm、5μm或10μm，内径为2.1mm、3mm或4.6mm，长度为50mm-300mm。

12、优选地，所述酸性水溶液包括磷酸水溶液、硫酸水溶液、氢氟酸水溶液、盐酸水溶液中的任一种，体积浓度为0.1-2％。

13、优选地，所述有机溶液的体积浓度为10％-50％，所述有机溶液包括乙腈溶液或甲醇溶液。

14、优选地，所述第一条件和所述第二条件中，所述酸性水溶液和所述有机溶的体积比为98:2-60:40，流速为0.2ml/min-1.2ml/min。

15、优选地，所述第一条件和所述第二条件中，柱温为20℃-40℃。

16、优选地，所述第一条件和所述第二条件中，进样体积为5μl-20μl。

17、优选地，所述发酵液包括苹果汁发酵液、葡萄汁发酵液、蓝莓汁发酵液、梨汁发酵液、柠檬汁发酵液、橙汁发酵液、桑椹发酵液、草莓发酵液中的任一种。

18、与现有技术相比，本申请的有益效果包括：

19、本申请提供的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，对奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸、丁酸采用同一检测波长进行检测，大大降低了发酵液内有机酸的检测复杂程度；同时，采用不同的标准品浓度，对发酵液内有机酸的检测更加精准。样本无需前处理，不需要进行真空抽滤、再溶解或长时间震荡提取等步骤，便可进样；采用了常见流动相，具有普适性，减少了人为因素造成的误差。检测时间短，检测种类多：在20-35min内可以检测8种有机酸。此外，还可以在相同的洗脱和检测条件的基础上，通过延长检测时间，增加有机酸的检测种类。

20、本申请提供的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，检测种类多、检测时间短、检测限低、精密度和回收率高。

技术特征：

1.一种快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述标准品混合溶液中，标准品的浓度范围为：奎宁酸0.1-1.5mg/ml、苹果酸0.1-1.3mg/ml、乳酸0.1-1.2mg/ml、乙酸0.3-4.2mg/ml、柠檬酸0.1-1.0mg/ml、琥珀酸0.2-2.0mg/ml、富马酸0.003-0.03mg/ml、丙酸0.0003-0.003mg/ml和丁酸0.0006-0.006mg/ml。

3.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述反相色谱柱包括c18色谱柱、c8色谱柱或c4色谱柱。

4.根据权利要求3所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述反相色谱柱的粒径为2.6μm、3μm、5μm或10μm，内径为2.1mm、3mm或4.6mm，长度为50mm-300mm。

5.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述酸性水溶液包括磷酸水溶液、硫酸水溶液、氢氟酸水溶液、盐酸水溶液中的任一种，体积浓度为0.1-2％。

6.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述有机溶液的体积浓度为10％-50％，所述有机溶液包括乙腈溶液或甲醇溶液。

7.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述第一条件和所述第二条件中，所述酸性水溶液和所述有机溶的体积比为98:2-60:40，流速为0.2ml/min-1.2ml/min。

8.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述第一条件和所述第二条件中，柱温为20℃-40℃。

9.根据权利要求1所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述第一条件和所述第二条件中，进样体积为5μl-20μl。

10.根据权利要求1-9任一项所述的快速检测发酵液中有机酸含量的方法，其特征在于，所述发酵液包括苹果汁发酵液、葡萄汁发酵液、蓝莓汁发酵液、梨汁发酵液、柠檬汁发酵液、橙汁发酵液、桑椹发酵液、草莓发酵液中的任一种。

技术总结
本申请提供一种快速检测发酵液中有机酸含量的方法，涉及检测技术领域。该方法包括：称取奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸、丁酸标准品，用去离子水配制成所需浓度的标准品混合溶液；使用所述标准品混合溶液和空白样进行高效液相色谱检测，以标准品的浓度为横坐标，以标准品的峰面积为纵坐标，分别绘制奎宁酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸、富马酸、丙酸、丁酸的标准曲线；以发酵液为待测样进行高效液相色谱检测，得到发酵液中有机酸的HPLC图谱；使用外标法计算待测样中酸的含量。本申请提供的方法，采用单一波长检测，降低检测复杂度，同时，检测时间短，结果精准。

技术研发人员：邓玉林,王丽卫,徐敏,辛念,许晴
受保护的技术使用者：北京理工亘舒科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24