一种定量检测全反式视黄醇与生育酚的方法及其应用与流程

本发明属于分析化学，具体涉及一种定量检测全反式视黄醇与生育酚的方法及其应用。

背景技术：

1、维生素广泛存在于各种生物体中，目前已发现的约有数十余类，其化学结构各异，有脂肪族、芳香族、脂环族、杂环和甾类化合物。在生理功能上，他们既不是构成各种组织的主要原料，也不是体内能量的来源，但他们是参与调解物质代谢过程必不可少的小分子有机化合物。

2、乳制品是人体所需全反式视黄醇与生育酚的重要来源，但全反式视黄醇与生育酚的化学性质不稳定，很容易受光、空气、温度影响而被氧化分解，同时动物源食品中蛋白脂肪含量高，干扰因素多。因此，高效提取和测定复杂基质中的全反式视黄醇与生育酚仍是维生素分析技术的难点。乳制品中全反式视黄醇与生育酚的分析常采用碱性皂化技术，皂化分为热皂化或冷皂化。热皂化通常用50％(w/v)的氢氧化钾或氢氧化钠(koh/naoh)水溶液和乙醇混合物在约80℃的水浴中震荡30分钟，同时加入丁基羟基甲苯(bht)抗氧化剂。冷皂化包括处理样品与水、乙醇和koh在25℃下缓慢恒定搅拌过夜。

3、皂化后液液提取(lle)或皂化后固相萃取(spe)是从乳制品中提取全反式视黄醇与生育酚的常见方法。皂化步骤和液液提取两个步骤，分析婴儿配方奶粉中的维生素a具体步骤如下：取约1g婴儿配方奶粉样品放入30ml棕色瓶中，加入皂化试剂(3ml水，10ml含0.1％bht和0.1％抗坏血酸的乙醇，1ml12.5mol/l naoh)。用氮气吹扫排除瓶内空气，并用带有真空阀的盖子密封起来。然后用铝箔包裹瓶子以屏蔽直射光，并置于80℃水浴中震荡1小时进行皂化。然后用40ml正己烷提取。提取液在氮气下干燥，用乙腈(含0.1％bha)复溶，进行液相色谱质谱检测器(lc/ms)分析。由于皂化后还需要液液提取，因此需使用大量有机溶剂，如正己烷、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、异辛烷等。

4、常规quechers方法测定强化酸奶中维生素d与k的步骤如下：将稀释后的酸奶样品(2ml)放入含有mgso4(4g)、nacl(1g)和乙腈(10ml)的50ml离心管中混合。旋转1分钟后，在3000rpm离心5分钟，乙腈萃取层(6ml)转移到含有mgso4(900mg)和psa(150mg)混合物的分散固相萃取(d-spe)瓶。d-spe瓶再次旋转和离心。上清液采用0.22μm pvdf注射器过滤器过滤后，注入uplc-ms/ms系统。常规的quechers方法没有做维生素a和e的，有维生素d和k的，维生素d和k没有采用皂化，采用乙腈提取，盐析剂分层，但是维生素a和e如果不皂化，直接采用维生素d和k的quechers方法，提取效率很低，并不适用。

5、cn108709942a公开了一种测定奶粉中维生素a，e的方法，包括以下步骤：1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、bht及koh水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；2)采用结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定步骤1)所得溶液中是否含有维生素a，e：若液相色谱结果显示样品疑似含有维生素a，e时，则比较样品与维生素a，e标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素a，e；3)若确认样品中含有维生素a，e，则通过公式计算样品中维生素a，e的含量。

6、因此，开发一种操作简单、成本低、快速高效的准确定量检测乳制品中全反式视黄醇与生育酚的方法，是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定量检测全反式视黄醇与生育酚的方法及其应用，该方法操作简单、成本低、快速、高效、准确。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种定量检测全反式视黄醇与生育酚的方法，所述方法包括如下步骤：

4、(1)将待测样品与异丙醇、bht混合，得到混合液；

5、(2)将所述混合液与koh水溶液混合，进行皂化反应，离心后收集有机相；

6、(3)将所述有机相加入盐酸中和残留的koh后，进行分散固相萃取，收集上清液，过滤后进行uplc-dad检测，根据检测谱图采用外标法测定待测样品中全反式视黄醇与生育酚的含量。

7、本发明采用异丙醇溶剂实现了皂化和quechers提取的同步进行，使分析物溶解在有机相中，不需要使用盐析剂即可实现水相-有机相分离，同时也避免使用常规的液液提取操作，减少了有机溶剂使用，简化了前处理操作步骤。

8、本发明中抗氧剂bht的加入可以有效减少视黄醇与生育酚的氧化降解。

9、本发明中加入koh溶液的目的是碱性皂化，去除脂肪等大分子干扰同时将酯形式的维生素a与e转化为视黄醇和生育酚。

10、优选地，所述待测样品包括固体样品水溶液或液体样品。

11、优选地，所述固体样品水溶液中固体样品与水的料液比为1:(4-6)，例如可以为1:4.5、1:5、1:5.5等。

12、优选地，所述混合液中bht与异丙醇的质量体积比为1:(480-520)，例如可以为1:490、1:500、1:510等。

13、优选地，所述混合液中待测样品与异丙醇的质量比为(0.25-0.50):1，例如可以为0.3:1、0.35:1、0.4:1、0.45:1等。

14、优选地，所述皂化反应的温度为70-85℃，例如可以为70℃、75℃、80℃、82℃、84℃等，时间为25-45min，例如可以为26min、28min、30min、32min、40min等。

15、优选地，所述分散固相萃取采用的试剂包括盐酸水溶液、无水硫酸镁和氨基吸附剂。

16、hcl的作用为中和皂化过程中的koh，去除碱性干扰，后续进行uplc-dad检测时保护色谱柱；无水mgso4的作用是去除异丙醇提取液中的水分，防止其对净化产生干扰；nh2吸附剂的作用是净化，除去提取液中的基质干扰，实现净化的作用。

17、优选地，所述过滤时采用0.20-0.50μm的过滤器，例如可以为0.22μm、0.30μm、0.40μm等。

18、优选地，所述uplc-dad检测的检测条件如下：agilent poroshell 120pfp色谱柱，参数：100×2.1mm，1.9μm，进样体积为2.0-5.0μl(例如可以为2.0μl、3.0μl、4.0μl、5.0μl等)，色谱柱温度30-40℃(例如可以为32℃、34℃、36℃、38℃等)，样品温度20-30℃(例如可以为22℃、24℃、26℃、28℃等)，流速0.2-0.6ml/min(例如可以为0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min等)，流动相a为去离子水，流动相b为甲醇，进行梯度洗脱。

19、优选地，所述全反式视黄醇的吸收波长为320-330nm，例如可以为322nm、324nm、326nm、328nm等。

20、优选地，所述生育酚的吸收波长为290-300nm，例如可以为292nm、294nm、296nm、298nm等。

21、优选地，所述梯度洗脱的程序包括：0-3min，75％b；3.0-5.0min，75-85％b；5.0-12.0min，85-90％b；12.1-14.0min，75％b。

22、优选地，所述方法包括如下步骤：

23、(1)待测样品包括固体样品水溶液或液体样品，固体样品水溶液中固体样品与水的料液比为1:(4-6)，将待测样品与异丙醇、bht混合，得到混合液；

24、混合液中bht与异丙醇的质量体积比为1:(480-520)，待测样品与异丙醇的质量比为(0.25-0.50):1；

25、(2)将所述混合液与koh水溶液混合，于70-85℃进行皂化反应25-45min，离心后收集有机相；

26、(3)将所述有机相加入盐酸中和残留的koh后，进行分散固相萃取，分散固相萃取采用的试剂包括盐酸水溶液、无水硫酸镁和氨基吸附剂，收集上清液进行0.20-0.50μm过滤，所得滤液进行uplc-dad检测，检测条件如下：进样体积为2.0-5.0μl，色谱柱温度30-40℃，样品温度20-30℃，流速0.2-0.6ml/min，流动相a为去离子水，流动相b为甲醇，进行梯度洗脱；

27、梯度洗脱的程序包括：0-3min，75％b；3.0-5.0min，75-85％b；5.0-12.0min，85-90％b；12.1-14.0min，75％b；

28、全反式视黄醇的吸收波长为320-330nm，生育酚的吸收波长为290-300nm，根据检测谱图采用外标法得出待测样品中全反式视黄醇与生育酚的含量。

29、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

30、第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的定量检测全反式视黄醇与生育酚的方法在乳制品检测中的应用，所述乳制品包括奶粉、酸奶、牛奶、羊奶或乳品饮料。

31、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

32、本发明采用异丙醇溶剂实现了皂化和quechers提取的同步进行，不需要使用盐析剂即可实现水相-有机相分离，减少了有机溶剂使用，简化了前处理操作步骤。

33、本发明提供的检测方法可以快速、简便、高效、准确地检测乳制品中的全反式视黄醇和生育酚的含量。