超分辨显微成像系统、待测样品的成像方法和基因测序仪与流程

本技术涉及基因测序，特别涉及一种超分辨显微成像系统、待测样品的成像方法和基因测序仪。

背景技术：

1、基因测序仪在测序过程中需要对atcg四种碱基分别进行荧光成像，由于检测的每个目标点都在亚微米尺度范围，因此需要借助“超分辨”的光学手段来实现检测目的。所谓的“超分辨”，就是超过光学系统的衍射极限。现有的主流三大超分辨技术，分别为受激辐射损耗（stimulated emission depletion，sted），荧光光敏定位显微镜（ fluorescencephotoactivation localization microscopy, fpalm）以及结构光照明超分辨显微镜（structured illumination microscopy, sim）。其中sted需要用高功率的激光来抑制非目标区的荧光信号，该方式虽然能实现超分辨，但是由于功率太高，不可避免的会损伤待测样本，因此不适合用于基因测序仪。

2、fpalm是一种采用时间换空间的方式，让荧光蛋白随机点亮，从而使得原本无法区分的两个荧光分子，由于发光时间的不一致，通过分别采集信号的方式实现区分，最终将多次采集的图像重建后得到一幅超分辨图像。该方式需要采集上千幅图像才能完整的检测到所有的荧光分子，耗时较长，也不适合应用在基因测序仪上。

3、最可能用于基因测序仪的超分辨技术为sim，该方法利用摩尔条纹的原理，即两个高频信息的叠加后为低频信息，从而使原来无法通过物镜的高频信息能被光学系统所接收，达到提高分辨率的作用。然而，常规的结构光照明超分辨显微镜虽然能提高显微系统的2倍分辨率，但激发光能损失严重，会造成大量的能量浪费，为了达到工作的功率要求，就需要较大功率的激光器，器件成本较高。另外，常规的结构光照明超分辨系统受限于衍射器件面阵的大小，照明面积很难提升，从而影响了基因测序仪的检测效率。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的问题之一。为此，本技术的目的在于提供一种超分辨显微成像系统、待测样品的成像方法和基因测序仪。

2、本技术提供一种超分辨显微成像系统。所述超分辨显微成像系统包括照明模块、分光镜、物镜、待测样品、成像模块和图像处理模块。所述照明模块用于发出激发光。所述照明模块包括光源、光纤分束组件和汇聚组件，所述光源用于发射出激发光，所述光源与所述光纤分束组件连接，所述光纤分束组件用于将所述激发光分束为第一激发光和第二激发光；所述汇聚组件设有两个光纤接口，所述光纤分束组件分别通过两个所述光纤接口与所述汇聚组件连接。所述汇聚组件用于通过两条汇聚支路分别汇聚所述第一激发光和第二激发光。所述汇聚组件可沿着所述第一激发光和所述第二激发光形成的中心对称线旋转，以在待测样品面上切换产生不同方向、不同相位的结构光干涉条纹。所述分光镜位于所述激发光的光路上，用于改变所述激发光的传播方向以照射到待测样品上。所述物镜位于所述激发光的光路上，用于汇聚所述第一激发光及所述第二激发光至所述待测样品上，以在所述待测样品面上形成结构光干涉条纹，所述待测样品面为所述物镜的焦面。所述待测样品设置在所述激发光的光路上且位于所述物镜下游，用于接收所述激发光以产生荧光，所述荧光被所述物镜收集经过所述分光镜。所述成像模块位于所述荧光的光路上且位于所述分光镜下游，用于接收所述荧光并根据不同方向、不同相位的所述结构光干涉条纹形成待测样品的多个荧光图像。所述图像处理模块与所述成像模块连接，用于接收所述多个荧光图像并根据所述多个荧光图像通过预设算法重建成一个超分辨图像。

3、如此，本技术的成像系统可以在样品面上形成结构光干涉条纹，避免衍射分光带来的光能损失，能量利用率较高，无需大功率的激光器，成本较低。另外，本技术可改变汇聚组件内器件的焦距、物镜的焦距、第一激发光及第二激发光出射的发散角，灵活调节照明模块照射在待测样品上的照明面积。

4、在某些实施方式中，所述光纤分束组件包括第一光纤、光纤分束器、第二光纤和第三光纤。所述光源通过所述第一光纤与所述光纤分束器连接，所述光纤分束器分别通过所述第二光纤和所述第三光纤与所述汇聚组件连接；所述光纤分束器用于将所述第一光纤发出的激发光等比例地分束为经过第二光纤的第一激发光和经过第三光纤的第二激发光；所述第二光纤和所述第三光纤分别通过两个光纤接口与所述汇聚组件连接。

5、如此，本技术的照明模块可以通过光纤分束组件将光源发出的激发光分束为第一激发光和第二激发光，从而可以在待测样品面上形成结构光干涉条纹。

6、在某些实施方式中，所述汇聚组件包括沿物镜光轴对称设置的第一汇聚模组和第二汇聚模组。所述第一汇聚模组包括第一准直透镜和第一汇聚透镜，所述第一准直透镜用于准直由经过所述第二光纤的光纤接口发出的所述第一激发光，所述第一汇聚透镜用于汇聚及发散经过所述第一准直透镜准直后的所述第一激发光，所述第一准直透镜与所述第一汇聚透镜形成第一汇聚支路。所述第二汇聚模组包括第二准直透镜和第二汇聚透镜，所述第二准直透镜用于准直经过由所述第三光纤的光纤接口发出的所述第二激发光，所述第二汇聚透镜用于汇聚经过所述第二准直透镜准直后的所述第二激发光，所述第二准直透镜与所述第二汇聚透镜形成第二汇聚支路。

7、如此，本技术的超分辨显微成像系统能够通过第一汇聚透镜汇聚经过第一准直透镜准直后的第一激发光形成第一汇聚支路，以及通过第二汇聚透镜汇聚经过第二准直透镜准直后的第二激发光形成第二汇聚支路，第一激发光通过第一汇聚透镜的焦点后逐渐发散，第二激发光通过第二汇聚透镜的焦点后逐渐发散，第一汇聚透镜的焦点和第二汇聚透镜的焦点处位于物镜的后焦面上，两束发散光被物镜准直成平行光，以使经第一汇聚支路的第一激发光和经第二汇聚支路的第二激发光被物镜准直成两束传播方向不同的平行光，分别为第一激发光和第二激发光，并在物镜的前焦面处干涉，在待测样品面上形成结构光干涉条纹。

8、在某些实施方式中，所述第一汇聚模组还包括设置在所述第一准直透镜和第一汇聚透镜之间的第一相位延迟器和/或位于所述第一准直透镜与所述第一相位延迟器之间的第一偏振旋转器，所述第一相位延迟器用于改变所述第一激发光的相位，使所述待测样品面上形成具有不同相位的结构光干涉条纹；所述第一偏振旋转器用于改变第一激发光的相位使所述第一激发光的偏振态与所述第二激发光的偏振态相同。

9、如此，本技术的超分辨显微成像系统可以通过设置在第一准直透镜和第一汇聚透镜之间的第一相位延迟器，可以改变第一激发光的相位，在待测样品面上形成具有不同相位的结构光干涉条纹。另外，本技术的超分辨显微成像系统还可以通过设置第一准直透镜与所述相位延迟器之间的第一偏振旋转器，改变第一激发光的相位使第二激发光的偏振态与第一激发光的偏振态相同。

10、在某些实施方式中，所述第二汇聚模组还包括设置在所述第二准直透镜和第二汇聚透镜之间的第二相位延迟器和/或位于所述第二准直透镜与所述第二相位延迟器之间的偏振旋转器，所述第二相位延迟器用于改变所述第二激发光的相位，使所述待测样品面上形成具有不同相位的结构干涉条纹；所述第二偏振旋转器用于改变第二激发光的相位使所述第二激发光的偏振态与所述第一激发光的偏振态相同。

11、如此，本技术的超分辨显微成像系统可以通过设置在第二准直透镜和第二汇聚透镜之间的第二相位延迟器，可以改变第二激发光的相位，在待测样品面上形成具有不同相位的结构光干涉条纹。另外，本技术的超分辨显微成像系统还可以通过设置第二准直透镜与所述相位延迟器之间的第二偏振旋转器，改变第二激发光的相位使第二激发光的偏振态与第一激发光的偏振态相同。

12、在某些实施方式中，所述第二光纤的光纤接口、所述第三光纤的光纤接口、所述第一准直透镜、所述第二准直透镜、所述第一汇聚透镜、所述第二汇聚透镜、所述第一相位延迟器、所述第二相位延迟器、所述第一偏振旋转器及所述第二偏振旋转器固定在所述汇聚组件中。所述第二光纤的光纤接口、所述第三光纤的光纤接口、所述第一准直透镜、所述第二准直透镜、所述第一汇聚透镜、所述第二汇聚透镜、所述第一相位延迟器、所述第二相位延迟器、所述第一偏振旋转器及所述第二偏振旋转器随着所述汇聚组件旋转而旋转。

13、如此，本技术的超分辨显微成像系统可以通过汇聚组件旋转，带动固定在汇聚组件中的所述第二光纤和第三光纤对应的光纤接口、第一准直透镜、第二准直透镜、第一汇聚透镜、第二汇聚透镜、第一相位延迟器、第二相位延迟器、第一偏振旋转器及第二偏振旋转器旋转，由此可以切换不同方向的结构光干涉条纹，在待测样品面上产生多种条纹方向不同的结构光，对三方向和三相位的结构光形成的荧光图像进行图像重建得到超分辨图像，可以提高超分辨显微成像系统的成像分辨率。

14、在某些实施方式中，所述第一准直透镜与所述第二准直透镜的焦距相等。所述第一汇聚透镜与所述第二汇聚透镜的焦距相等。所述照明模块发出的所述激发光照射在所述待测样品上的照明面积与所述准直透镜的焦距、所述汇聚透镜的焦距、所述物镜的焦距及所述第二光纤和所述第三光纤出光的发散角相关。

15、如此，本技术的超分辨显微成像系统的第一准直透镜和第二准直透镜的焦距相等，以及第一汇聚透镜与第二汇聚透镜的焦距相等，以使照明模块可以射出两条相同的激发光。此外，本技术可以通过调整准直透镜的焦距、汇聚透镜的焦距、物镜的焦距和第二光纤和第三光纤出光的发散角中的任意一个或多个，增加或减小照明模块发出的激发光照射在待测样品上的照明面积，超分辨显微成像系统的照明面积可以灵活调节。

16、在某些实施方式中，入射至所述物镜的所述第一激发光和所述第二激发光由所述物镜的边缘孔径入射，且所述第一激发光和所述第二激发光各自的光轴与所述物镜的光轴之间的距离相同，且三个光轴位于同一平面上。

17、如此，本技术的超分辨显微成像系统入射至物镜的第一激发光和第二激发光可以由物镜的边缘孔径入射，以第一激发光和第二激发光各自的光轴与物镜的光轴之间的距离相同，三个光轴位于同一平面上，保证第一激发光和第二激发光在经物镜汇聚后能够在待测样品的物面上干涉形成结构光干涉条纹。

18、本技术还提供一种待测样品的成像方法，应用上述实施方式中所述的超分辨显微成像系统。所述待测样品的成像方法包括：控制所述照明模块的所述光源发出激发光及经过所述光纤分束组件将所述激发光分束形成所述第一激发光和所述第二激发光，及控制可旋转变化的所述汇聚组件向预设方向旋转预设角度以形成多个方位且相位不同的所述第一激发光和所述第二激发光；获取经过所述汇聚组件发射出的多个方位且相位不同的所述第一激发光和所述第二激发光激发所述待测样品产生荧光，在所述成像模块上接收所述荧光并根据不同方向、不同相位的结构光干涉条纹形成所述待测样品的多个荧光图像；通过图像处理模块接收多个所述荧光图像并根据多个方位的所述荧光图像通过预设算法重建成一个超分辨图像。

19、如此，本技术的成像系统可以在待测样品面上形成结构光干涉条纹，避免衍射分光带来的光能损失，能量利用率较高，无需大功率的激光器，成本较低。另外，本技术可改变汇聚组件内器件的焦距、物镜的焦距、第一激发光及第二激发光出射的发散角，灵活调节照明模块照射在待测样品上的照明面积。

20、本技术还提供一种基因测序仪。所述基因测序仪包括上述实施方式中所述的超分辨显微成像系统。

21、如此，本技术的基因测序仪的超分辨显微成像系统可以在待测样品面上形成结构光干涉条纹，避免衍射分光带来的光能损失，能量利用率较高，无需大功率的激光器，成本较低。另外，本技术可改变汇聚组件内器件的焦距、物镜的焦距、第一激发光及第二激发光出射的发散角，灵活调节照明模块照射在待测样品上的照明面积。