一种CeO2@PtRu纳米酶及其制备方法与应用

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种多金属纳米酶的制备及其在创伤弧菌检测方面的应用。

背景技术：

1、创伤弧菌是海洋中的一种革兰氏阴性的嗜盐性弧菌，它是全球重要的海洋致病细菌，与霍乱弧菌、肠炎弧菌并列为造成人类感染疾病之三大弧菌之一。自然生长在温暖海水中，常寄生在贝壳类的海洋生物中(如牡蛎、蛤、贻贝等)。室温下的创伤弧菌在受污染的海产品中可以大量繁殖，处置不当时可感染人类致病。全国每年都有许多因为处理海鲜产品时操作不当而引起创伤弧菌感染事件。

2、高灵敏度的创伤弧菌检测方法的开发和应用对于食品安全检测、创伤弧菌感染的预防及诊断治疗尤为重要。除了传统的细菌培养及生物鉴定，越来越多的检测方法被尝试和发掘，例如酶联免疫吸附法、电化学检测、荧光检测、pcr扩增以及试纸条等，均在不同的细菌检测领域被应用和扩展。但这些方法仍然存在着一些缺陷，例如：酶联免疫吸附法虽然存在良好的特异性和灵敏度，但花费时间很长且费用较高；电化学检测对温度有一定的限制且使用寿命短；pcr检测需要专业人员操作，时间长，成本高；试纸条极易出现假阳性，需要多轮实验进行筛查等缺陷。因此，需要我们进一步开发新型高灵敏度的、简便的、价廉的创伤弧菌检测方法。

3、纳米酶是一类无机材料合成的天然酶模拟酶，既具有纳米材料的性质，又具有天然酶的性质。与传统的天然酶相比，纳米酶克服了天然酶易受环境影响而使酶活性降低甚至失去的缺陷；并且，纳米酶具有生产成本低、稳定性好、催化效率高以及可规模化生产制备的优点。此后，纳米酶被广泛的应用于医学诊断、化学分析、生物传感和环境监测等不同领域。在细菌检测方面，已经发现许多用于定性及定量检测的基于纳米酶的免疫分析方法，但寻找一种高效、灵敏度高、成本低的纳米酶，依然具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决传统技术中检测细菌耗时长、成本高、操作复杂等特点，本发明的第一个目的是合成了一种三金属纳米酶，该三金属纳米酶稳定性优良，催化活性高，具有取代天然酶的潜力。

2、本发明的第二个目的是提供上述三金属纳米酶的制备方法，其制备方法简单、安全、高效、产率较高，易于为后续的表征和实验提供丰富的原材料，减少重复实验的时间。

3、本发明的第三个目的是提供上述三金属纳米酶的对海洋性致病菌创伤弧菌进行检测的应用。

4、为了解决以上技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

5、一种ceo2@ptru纳米酶的制备方法，是以六水硝酸铈为前驱体合成纳米球，再加入氯亚铂酸钾、无水氯化钌高温热解得到ceo2@ptru纳米酶。

6、进一步的，上述的ceo2@ptru纳米酶的制备方法，依次包括下述步骤：

7、1)制备ceo2纳米球

8、将六水硝酸铈和聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇中，磁力搅拌直至溶液澄清；加入稀盐酸调节溶液ph至2.0～3.0，剧烈搅拌30～40min后将其转移到的高压釜内衬中，烘箱在155-165℃下加热1-4小时；冷却后收集得到灰色溶液，离心并用纯水清洗，收集沉淀并烘干得到ceo2纳米球颗粒；

9、所述的六水硝酸铈、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为：1.0∶0.3-0.6，

10、2)修饰铂系金属元素

11、将ceo2纳米球颗粒分散至超纯水中，超声5～8min，再加入氯亚铂酸钾和无水氯化钌，混合均匀后，油浴升温至80～90℃，搅拌1～2h后，得到黑色产物溶液，离心并用纯水洗涤后收集的产物即为ceo2@ptru纳米酶；

12、ceo2纳米球颗粒、氯亚铂酸钾、无水氯化钌的质量比：36∶10-16∶15-18。

13、更进一步的，上述的ceo2@ptru纳米酶的制备方法，依次包括下述步骤：

14、1)制备ceo2纳米球

15、将六水硝酸铈和聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇中，磁力搅拌直至溶液澄清；加入稀盐酸调节溶液ph至，剧烈搅拌30～40min后将其转移到的高压釜内衬中，烘箱在160℃下加热3小时；冷却后收集得到灰色溶液，离心并用纯水清洗，收集沉淀并烘干得到ceo2纳米球颗粒；

16、所述的六水硝酸铈、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为：1.0∶0.4，

17、2)修饰铂系金属元素

18、将ceo2纳米球颗粒分散至超纯水中，超声5～8min，再加入氯亚铂酸钾和无水氯化钌，混合均匀后，油浴升温至80～90℃，搅拌1～2h后，得到黑色产物溶液，离心并用纯水洗涤后收集的产物即为ceo2@ptru纳米酶；

19、ceo2纳米球颗粒、氯亚铂酸钾、无水氯化钌的质量比：36∶14∶16.5。

20、步骤1)所述离心参数为10000rpm、20min；

21、步骤2)所述离心参数为8000rpm、12min。

22、进一步的，上述的ceo2@ptru纳米酶的制备方法，所述的溶剂为乙二醇。

23、进一步的，上述的ceo2@ptru纳米酶的制备方法，所述的稀盐酸为1m稀盐酸。

24、本发明提供的第二个技术方案是一种ceo2@ptru纳米酶，采用第一个技术方案所述的方法制备得到的。

25、本发明提供的第二个技术方案是一种检测海洋性致病菌创伤弧菌的材料，将所述的ceo2@ptru纳米酶通过生物素-链霉亲和素系统与多克隆抗体相偶联得到的ceo2@ptru-pab。

26、其具体制备方法如下：

27、1)生物素标记抗体

28、称取3.4mg生物素琥珀酰亚胺酯溶于1ml无水二甲基亚砜中，并放在4℃冰箱中备用。抽取40μl活化脂生物素至500μl多克隆抗体溶液中，轻轻摇匀；在2～8℃下静置2h，再转移到室温下反应0.5～1h。最后用pbs(ph 9.6)透析24h，收集产品至离心管中，保存到4℃中待用。定义为溶液a。

29、2)链霉亲和素结合纳米酶

30、称取一定量的纳米酶溶解在20ml去离子水中，超声5min，观察固体颗粒完全溶解；再加入5ml巯基乙酸(1m)，在室温下磁力搅拌3小时后，离心并用25％乙醇、纯水依次洗涤3次，收集沉淀即为羧化后的纳米酶。

31、称取6.0mg羧化后的纳米酶溶于6ml pbs中，将3ml、50mm edc和0.75ml、50mm nhs加入上述溶液中，在25℃下活化30min；经过离心洗涤后收集沉淀得到活化后的纳米酶；将其悬浮于6mlpbs中，加入500μg链霉亲和素，在培养箱中轻摇反应2h进行酰胺化反应，加入3ml1.5％w/v bsa溶液在37℃下阻断半小时，再次通过离心去除未参与反应的bsa及多余的链霉亲和素，最后重悬沉淀于一定量水中，并在此处确定溶液浓度；定义为溶液b。

32、3)取400μl溶液b和100μl溶液a充分混匀，在室温下反应1h后，得到成功偶联的抗体和纳米酶结合物：ceo2@ptru-pab将其保存在4℃中。

33、离心参数为：8000rpm、12min。

34、离心洗涤液为：含有1％吐温-20的1x pbs。

35、溶液含量比为，a液：b液＝1：4。

36、本发明提供的第四个技术方案是一种检测海洋性致病菌创伤弧菌的方法，ceo2@ptru-pab催化过氧化氢氧化tmb生成oxtmb，反应体系出现的蓝色变化，用以定性检测创伤弧菌；并且，在特定波长处有紫外可见吸收峰，可通过相应的吸光度值来定量检测创伤弧菌。

37、更具体地说，在104～109cfu/ml的细菌浓度范围内，加入ceo2@ptru-pab溶液，在37℃水浴箱中反应15min，观察反应体系颜色变化来定性检测创伤弧菌；并测定其在400～800nm波长范围内的吸光度值，绘制浓度-吸光度工作曲线，定量检测未知浓度的创伤弧菌。

38、方法具体为：

39、用无菌pbs对创伤弧菌进行10倍稀释，将细菌浓度依次稀释为109、108、107、106、105、104cfu/ml；取出96孔板，每孔加入50μl梯度浓度的创伤弧菌标准溶液及100μl的ceo2@ptru-pab，用透明薄膜覆盖在室温下静置一段时间，等待纳米酶与细菌充分富集。再加入100μl优化条件后的显色液，37℃水浴箱中反应15min，利用酶标仪测量吸光度及吸收曲线。

40、空白对照组为无菌pbs。

41、最佳细菌富集时间为20～25min。

42、优化后的显色液中，1ml显色液中tmb的浓度及含量为8mm、120μl。

43、所述ceo2@ptru纳米酶应用于创伤弧菌原理如下：

44、无色的tmb可以被该酶催化h2o2生成的·oh氧化为oxtmb，此时溶液颜色会由无色转化为蓝色，该法证明了纳米酶的过氧化物酶样活性。

45、利用生物素-链霉亲和素系统将抗创伤弧菌多克隆抗体与纳米酶进行偶联后，将其应用于创伤弧菌的检测。当创伤弧菌存在时，与抗体结合后的ceo2@ptru纳米酶的显色位点被细菌覆盖，ceo2@ptru纳米酶的催化位点减少，则催化h2o2氧化tmb溶液显色的能力减弱。通过溶液颜色变化来定性检测海洋性致病菌创伤弧菌，再利用酶标仪对其进行吸光度的测量，从而定量检测细菌。

46、与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

47、1)与传统的纳米酶的制备方法相比，本发明提供的ceo2纳米颗粒含有丰富的氧空穴，使其可以作为催化反应的活性位点及载体。并且，该纳米酶是直接利用氧化铈表面的还原电势直接产生均匀固定在氧化铈纳米球表面的高密度金属纳米粒子，使得ceo2@ptru纳米酶的制备过程非常简单，两步法即可成功合成。该纳米酶的优点包含：水分散性优良，稳定性好，不易受环境因素例如温度、ph等干扰。并且，与现有的多数纳米酶相比，ceo2@ptru纳米酶具有优异的过氧化物酶活性，具备取代天然酶的潜力。

48、2)与传统的静电吸附方式结合抗体的方法相比，本发明提供的技术方案采用的生物素-链霉亲和素系统可极大程度的提高结合的灵敏度；亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂，一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。

49、3)本发明提供的技术方案利用生物素与链霉亲和素的超强亲和力参与抗原抗体亲和反应流程，给予抗原与抗体更加广阔的反应空间或者更长的反应时间，从而极大幅度的提高反应的灵敏度。生物素与亲和素间的作用是已知强度最高的非共价作用，亲和常数(k)为1015mol/l，比抗原与抗体间的亲和力(k＝105～1011mol/l)至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好，专一性强，不受试剂浓度、ph环境、抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。

50、4)本发明提供的技术方案制备得到的纳米酶应用于海洋性致病菌创伤弧菌的比色检测，可快速、准确地检测细菌数量，检测限低，具有高效检测细菌的潜力；本发明提供的基于纳米酶的免疫检测方法操作简便、耗时短、无需复杂仪器参与操作且成本低，测试结果可直观的由紫外-可见吸收光谱显示。结果表明，该方法对创伤弧菌的检测范围为106～109cfu/ml，检出限为0.975cfu/ml。该方法对检测环境的温度、酸碱度等都有良好的抗干扰性，在细菌检测及医用海洋性致病菌的治疗前诊断环节中有广阔的应用前景。

51、总而言之，本发明提供的基于ceo2@ptru纳米酶的比色免疫分析方法与传统的细菌检测方法相比，耗时短、价廉，利用非常简单的操作过程即可成功实现对海洋性致病菌创伤弧菌的灵敏高通量检测。