本发明涉及生化,更具体地,涉及一种胶乳试剂及制备方法、尿微量白蛋白检测试剂盒及制备方法。
背景技术:
1、尿微量白蛋白(malb)是指在尿液中出现微量白蛋白,人体代谢正常情况下,尿液中白蛋白含量极少,但糖尿病、肾病、高血压肾病等早期肾脏受损和心血管疾病并发症等发生时会造成肾脏固有细胞损伤,使肾脏固有细胞结构及功能发生变化而导致白蛋白含量在尿液中的升高。现有技术中检测malb的方法主要为胶乳免疫比浊法,胶乳免疫比浊法是一种将抗原或者抗体标记到胶乳颗粒上制备成胶乳溶液,并与相应的抗原或者抗体溶液混合后引起抗原抗体反应形成一定的浊度,检测浊度的变化从而判定抗体或抗原浓度的方法。
2、随着检验医学的发展,对于胶乳免疫比浊法的检测试剂的灵敏度和线性范围的要求越来越高。目前市场上采用大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球混合,并优化大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球的平均直径和浓度,以同时达到提高试剂灵敏度和线性范围的效果。中国专利cn111766381a公开了一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用,针对不同粒径的胶乳微球分别优化了活化剂和抗体的用量,通过将两种平均粒径不同的胶乳微球按照一定比例混合制备出的试剂可以提高试剂盒的灵敏度和线性宽度,然而大粒径胶乳微球具有较大的体积,布朗运动及表面电荷对微球悬浮稳定性所起的作用相对较弱,往往不足以确保微球组分在有效期内的稳定贮存。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷,提供一种灵敏度高、线性范围宽和稳定性高的胶乳试剂及制备方法、尿微量白蛋白检测试剂盒及制备方法。
2、为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
3、一种胶乳试剂,所述胶乳试剂主要由胶乳微球与抗体、第一封闭剂、第二封闭剂和第三封闭剂偶联得到;
4、所述第一封闭剂包括blockmastertm db1130;
5、所述第二封闭剂包括blockmastertm pa1080;
6、所述第三封闭剂包括牛血清白蛋白;
7、所述胶乳试剂中,所述胶乳微球的固含量为0.05%~0.1%,所述抗体的浓度为0.05mg/l~0.2mg/l,所述第一封闭剂的含量为0.02%~1%,所述第二封闭剂的含量为0.05%~5%,所述第三封闭剂的含量为0.1%~5%。
8、本发明还提供了一种如上述的胶乳试剂的制备方法,包括以下过程:
9、将所述胶乳微球与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化,得到活化反应液;
10、所述抗体经偶联缓冲液稀释后加入到所述活化反应液中进行偶联,得到偶联反应液;
11、向所述偶联反应液中加入第一封闭剂进行一次封闭,得到一次封闭后的反应液;
12、向所述一次封闭后的反应液中加入第二封闭剂进行二次封闭,得到二次封闭后的反应液;
13、向所述二次封闭后的反应液中加入第三封闭剂进行三次封闭,得到三次封闭后的反应液;
14、对所述三次封闭后的反应液进行固液分离,重悬得到所述胶乳试剂。
15、本发明还提供了一种尿微量白蛋白检测试剂盒,包括r2试剂;
16、所述r2试剂包括以下浓度的组分:
17、25mm~50mm的r2缓冲液、50%~90%的第一胶乳试剂和10%~50%的第二胶乳试剂;
18、所述第一胶乳试剂主要由第一胶乳微球与第一抗体、第一封闭剂、第二封闭剂和第三封闭剂偶联得到;
19、所述第二胶乳试剂主要由第二胶乳微球与第二抗体、第一封闭剂、第二封闭剂和第三封闭剂偶联得到;
20、所述第一胶乳试剂中,所述第一胶乳微球的固含量为0.05%~0.1%,所述第一抗体浓度为0.05mg/l~0.2mg/l,所述第一封闭剂的含量为0.02%~1%,所述第二封闭剂的含量为0.05%~5%,所述第三封闭剂的含量为0.1%~5%;
21、所述第二胶乳试剂中,所述第二胶乳微球的固含量为0.05%~0.1%,所述第一抗体浓度为0.05mg/l~0.1mg/l,所述第一封闭剂的含量为:0.02%~1%,所述第二封闭剂的含量为:0.05%~5%,所述第三封闭剂的含量为0.1%~5%;
22、所述第一封闭剂包括blockmastertm db1130;
23、所述第二封闭剂包括blockmastertm pa1080;
24、所述第三封闭剂包括牛血清白蛋白;
25、所述第一抗体和所述第二抗体均为尿微量白蛋白抗体;
26、所述第一胶乳微球的粒径为60nm~90nm;
27、所述第二胶乳微球的粒径为350nm~400nm。
28、本发明还提供了一种如上述的尿微量白蛋白检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
29、将所述第一胶乳微球和所述第二胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化,分别得到第一反应液和第二反应液;
30、所述第一抗体经偶联缓冲液稀释后加入到所述第一反应液中进行偶联,所述第二抗体经偶联缓冲液稀释后加入到所述第二反应液中进行偶联,分别得到第一偶联反应液和第二偶联反应液;
31、向所述第一偶联反应液和所述第二偶联反应液中分别加入第一封闭剂进行一次封闭,分别得到一次封闭后的第一反应液和一次封闭后的第二反应液;
32、向所述一次封闭后的第一反应液和所述一次封闭后的第二反应液中分别加入第二封闭剂进行二次封闭,分别得到二次封闭后的第一反应液和二次封闭反应后的第二反应液;
33、向所述二次封闭后的第一反应液和所述二次封闭后的第二反应液中分别加入第三封闭剂进行三次封闭,分别得到三次封闭后的第一反应液和三次封闭反应后的第二反应液;
34、对所述三次封闭后的第一反应液和所述三次封闭后的第二反应液分别进行固液分离,分别得到所述第一胶乳试剂和所述第二胶乳试剂;
35、将所述第一胶乳试剂和所述第二胶乳试剂分别加入r2缓冲液进行混合,得到所述r2试剂。
36、实施本发明实施例,将具有如下有益效果:
37、本发明实施例通过第一封闭剂、第二封闭剂和第三封闭剂的组合使用,先加入小分子量的第一封闭剂,封闭微球上的各个未连接抗体的基团,尤其是被抗体遮挡的基团,再依次加入大分子量的第二封闭剂和第三封闭剂,第二封闭剂中的大分子链导入了亲水基团和疏水基团,因此可以吸附到胶乳微球的表面区域和表面基团上,从而阻止胶乳微球吸附不参与免疫反应的组分,抑制胶乳的非特异性凝集,并对胶乳微球上未连接抗体的基团进行再次封闭,第三封闭剂可对抗体除了与抗原发生反应的表位外的其他位点进行充分的封闭。因此,本发明实施例采用不同的分子量封闭剂混合使用,可以更有效的封闭胶乳微球表面上暴露的所有位点,从而达到提高试剂的胶乳稳定性目的。
1.一种胶乳试剂,其特征在于,所述胶乳试剂主要由胶乳微球与抗体、第一封闭剂、第二封闭剂和第三封闭剂偶联得到;
2.一种如权利要求1所述的胶乳试剂的制备方法,其特征在于,包括以下过程:
3.根据权利要求2所述的胶乳试剂的制备方法,其特征在于,所述活化的温度为30℃~37℃,所述活化的时间10min~20min;
4.根据权利要求2所述的胶乳试剂的制备方法,其特征在于,所述胶乳微球与所述活化缓冲液的质量比为1:(5~20);
5.一种尿微量白蛋白检测试剂盒,其特征在于,包括r2试剂;
6.根据权利要求5所述的尿微量白蛋白检测试剂盒,其特征在于,还包括r1试剂;所述r1试剂包括以下浓度的组分:
7.根据权利要求6所述的尿微量白蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述r1缓冲液和所述r2缓冲液分别包括3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、2-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸盐和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或两种以上。
8.根据权利要求6所述的尿微量白蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述第一稳定剂和所述第二稳定剂分别包括氯化钠、氯化钙、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上;
9.一种如权利要求5-8中任意一项所述的尿微量白蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
10.根据权利要求9所述的尿微量白蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述第一胶乳微球与所述活化缓冲液的质量比为1:(5~20);