烟酸原料药中有关物质的检测方法与流程

本发明属于原料药检测，具体涉及一种烟酸原料药中有关物质的检测方法。

背景技术：

1、烟酸(nicotinic acid)属于维生素b族，用于预防和治疗烟酸缺乏症，治疗糙皮症。

2、烟酸的主流合成工艺中，采用以3-甲基吡啶作为起始物料，3-甲基吡啶经氨氧化生成3-氰基吡啶，3-氰基吡啶碱性条件下水解生成烟酰胺，烟酰胺水解生成烟酸，该反应工艺的中间体为3-氰基吡啶和烟酰胺。

3、通常在对3-甲基吡啶的提取纯化工艺中，根据物质的沸点差异采用蒸馏的方式进行纯化，而3-甲基吡啶物料中存在各种同分异构体杂质，如2-甲基吡啶及4-甲基吡啶，均与3-甲基吡啶非常相近，难以分离。

4、因此，在烟酸的合成工艺中，反应步骤多，副反应复杂，应对每一步的中间产物进行检测及控制，才能更好的把控产品的质量。

5、针对烟酸中烟酰胺的检测方法已有公开，但是，同时测定中间体3-氰基吡啶、烟酸的异构体2-吡啶甲酸、起始物料3-甲基吡啶及其同分异构体2-甲基吡啶及4-甲基吡啶杂质的方法未见报道，2020年版中国药典中规定3-氰基吡啶不得过0.25％，其他杂质未控制；药典中3-氰基吡啶的检测方法使用了薄层色谱法，该方法专属性和准确性均不佳；对于药典中未明确控制的其他杂质的控制，适用国际人用药品注册技术协调会制定的ich指导原则。

6、在烟酸有关物质的检测中，2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶互为同分异构体，烟酸与2-吡啶甲酸互为同分异构体，因同分异构体之间具有相似的结构和极性，在液相色谱条件下选择性相近，这些同分异构体常常难以实现分离。

7、并且，主成分烟酸及各杂质分子量小，极性大，在反向高效液相色谱中保留能力差，通常在高效液相色谱图中在2分钟以内出峰，从而难以进行分离，方法开发难度较大。因此，对烟酸原料药进行质量控制，尚有较大的探索空间。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种烟酸原料药中有关物质的检测方法，通过该方法，2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-吡啶甲酸及3-氰基吡啶与烟酸的色谱峰分离度均不小于1.5，线性关系良好，实现对两组同分异构体的分离控制，对烟酸原料药进行质量控制。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、烟酸原料药中有关物质的检测方法，包括以下步骤：

4、对烟酸原料药待测溶液进行高效液相色谱法检测，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以ph＝2.0～4.0的2～10mmol/l辛烷磺酸钠溶液为流动相a，甲醇为流动相b进行梯度洗脱；检测波长：260～280nm；进样量：10～50μl；流速：0.4～0.6ml/min；色谱柱温度：25～40℃。

5、进一步，所述有关物质包括2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-吡啶甲酸和/或3-氰基吡啶。

6、又，所述梯度洗脱过程为：以体积百分数为90％～95％的流动相a、5～10％的流动相b为起始流动相进行等度洗脱，烟酸被洗脱结束后，以95～80％的流动相a、5～20％的流动相b洗脱3～15分钟，不再有色谱峰被洗脱出后，以不低于50％的流动相b洗脱至少3分钟后，恢复起始流动相进行平衡，平衡时间不小于5分钟。

7、优选地，所述梯度洗脱过程为：以体积百分数为95％的流动相a、5％的流动相b为起始流动相进行等度洗脱，烟酸峰洗脱结束后，以体积百分数为80％的流动相a、20％的流动相b洗脱，不再有色谱峰被洗脱出后，以不低于50％的流动相b洗脱至少5分钟后，恢复至起始流动相进行平衡。

8、又，所述起始流动相的等度洗脱时间为3～10分钟，所述有关物质还包括4-吡啶甲酸和/或烟酰胺。

9、优选地，所述色谱柱选自waters x-bridge系列或thermo hypersil bds 18系列。

10、又，所述色谱柱填料粒径≤5μm，长度≥5cm，内径≤4.6mm。

11、进一步，所述流动相a中，用磷酸调节ph值。

12、优选地，所述烟酸原料药待测溶液中烟酸的浓度为0.2～0.5mg/ml。

13、又，所述流动相a中，辛烷磺酸钠溶液的浓度为2.3～5mmol/l，用磷酸调节ph值至2.5，色谱柱温度：30℃；进样量：20μl，流速：0.5ml/min。

14、本发明的待测对象中，2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶互为同分异构体，烟酸和2-吡啶甲酸互为同分异构体，两组物质在反相色谱中没有明显可区分的特点，并且，待分离的各组分均为大极性小分子化合物，保留能力弱，在保留能力很弱的前提下，各待测组分的分离空间更为有限。因此，在一般液相色谱体系中，这些同分异构体通常难以被分离。

15、本发明中，以2～10mmol/l辛烷磺酸钠溶液作为流动相a，辛烷磺酸钠作为离子对试剂能够存在于液相色谱体系中，与色谱柱填料进行作用，增强待分离物质的保留能力，若流动相中辛烷磺酸钠含量过低，会影响2-吡啶甲酸与3-氰基吡啶的分离度，导致两者难以分离。

16、在反相色谱体系中，水相为固定相，有机溶剂为洗脱剂，流动相中水比例越高，待测组分越不溶液被洗脱，保留能力越强，然而硅胶溶于水，普通c18柱流动相中通常水比例不超过90％，本发明采用亲水的强保留色谱体系，可以耐高水比例流动相，流动相中水的比例可高达95％，使得烟酸及其同分异构体2-吡啶甲酸之间能够进行分离，另一组同分异构体中3-甲基吡啶峰与4-甲基吡啶出峰完全重合，因此做合并控制，4-甲基吡啶峰与其他待测组分均可分离。

17、在高效液相色谱检测中，进样量越大时色谱峰面积越大，但色谱峰面积过大会使检测器过载，无法准确测量；而色谱峰面积过小时，误差对检测结果的影响较大，本发明中采用10～50μl的进样量，以保证目标色谱峰面积处于合适范围，减少峰面积对分离效果的影响，提升检测结果的准确性。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、本发明中，对烟酸原料中的2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-吡啶甲酸、3-腈基吡啶进行定量检测，使用同一色谱条件对两组同分异构体进行了分离，并且能够对各组分的含量进行有效的定量分析，具有高效性和经济性。

20、本发明中，各杂质之间分离度良好，各峰与烟酸峰的分离度不低于1.5，3-甲基吡啶和4-甲基吡啶出峰一致，可进行合并控制，其余色谱峰之间最小分离度为2.8，目标色谱峰峰形尖锐，对称性良好，结果可信度高，为烟酸原料药的质量检测提供了可靠的检验基础。

技术特征：

1.烟酸原料药中有关物质的检测方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质包括2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-吡啶甲酸和/或3-氰基吡啶。

3.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：以体积百分数为90％～95％的流动相a、5～10％的流动相b为起始流动相进行等度洗脱，烟酸被洗脱结束后，以95～80％的流动相a、5～20％的流动相b洗脱3～15分钟，不再有色谱峰被洗脱出后，以不低于50％的流动相b洗脱至少3分钟后，恢复起始流动相进行平衡，平衡时间不小于5分钟。

4.根据权利要求3所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：以体积百分数为95％的流动相a、5％的流动相b为起始流动相进行等度洗脱，烟酸洗脱结束后，以体积百分数为80％的流动相a、20％的流动相b洗脱，不再有色谱峰被洗脱出后，以不低于50％的流动相b洗脱至少5分钟后，恢复至起始流动相进行平衡。

5.根据权利要求3所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述起始流动相的等度洗脱时间为3～10分钟，所述有关物质还包括4-吡啶甲酸和/或烟酰胺。

6.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱选自waters x-bridge系列或thermo hypersil bds18系列。

7.根据权利要求6所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱填料粒径≤5μm，长度≥5cm，内径≤4.6mm。

8.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相a中，用磷酸调节ph值。

9.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述烟酸原料药待测溶液中烟酸的浓度为0.2～0.5mg/ml。

10.根据权利要求1所述烟酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相a中，辛烷磺酸钠溶液的浓度为2.3～5mmol/l，用磷酸调节ph值至2.5，色谱柱温度：30℃；进样量：20μl，流速：0.5ml/min。

技术总结
烟酸原料药中有关物质的检测方法，所述有关物质包括2‑甲基吡啶、3‑甲基吡啶、4‑甲基吡啶、2‑吡啶甲酸和/或3‑氰基吡啶，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以pH＝2.0～4.0的2～10mmol/L辛烷磺酸钠溶液为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱；检测波长：260～280nm；进样量：10～50μl；流速：0.4～0.6ml/min；色谱柱温度：25～40℃，在同一色谱条件下对两组同分异构体实现了分离，并且能够对各组分的含量进行有效的定量分析，结果可信度高，具有高效性和经济性，为烟酸原料药的质量检测提供了可靠的检验基础。

技术研发人员：高衎,杨易可,周洁,赵帅旗,李丽霞
受保护的技术使用者：上海旭东海普药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25