一种检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法与流程

本发明属于血药浓度检测。更具体地，涉及一种检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法。

背景技术：

1、在治疗或缓解精神疾病及症候群方面，精神类药物虽有着重要的作用，但其临床应用仍存在诸多难题。例如：（1）精神疾病多属于慢性病，需长期用药，而精神类药物的不良反应较多；（2）精神类药物药动学上的个体差异非常明显，相同剂量的血药浓度可相差几倍到几十倍；（3）精神类药物的疗效指标不够简明且受医生主观因素影响；（4）精神类药物的中毒反应可隐匿性出现，不易与疾病本身症状的加重相区别；（5）精神类药物的血药浓度与疗效和毒副作用相关，过高或过低，疗效均不好。因此，如何选好、用好精神类药物，保证精神疾病药物治疗的有效性和安全性是精神疾病治疗面临的一个重要问题。

2、治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，tdm）是通过对生物样本中的药物、生物标志物等进行分析，以获得最佳疗效和最小不良反应，并实现个体化治疗的技术。《中国精神科治疗药物监测临床应用专家共识》和《agnp神经精神药理学治疗药物检测共识指南》均指出，治疗药物监测是实现精神疾病的个体化精准药物治疗的重要手段。鉴于精神类药物的用药时间长、不良反应大、血药浓度与疗效和毒副作用相关，有必要对精神类药物实施定期的、合理的治疗药物监测。

3、目前，精神类药物的tdm多基于传统检测基质进行，如血浆、血清及全血等。但此类检测基质需由专业人员进行采集、分离并需冷藏保存，采集不便，且由于tdm的周期较长，检测频次较高，血液采集量较大，容易增加患者的心理及身体负担，难以实现血药浓度的及时监控。干血片采样技术是将血液滴加在滤纸片上，自然干燥后得到待测样本的一种方法。相较于全血基质样品，干血片采样具有所需样本量少、采集方便、微创、成本低、更易保存和运输等优势，且拥有很好的生物安全性，是一项极具应用前景的采样技术。但基于干血片的精神类药物的tdm也存在诸多难题。例如：由于血液样本吸附于滤纸片上，检测干血片样本中的药物含量时，存在样本释放不充分的问题。同时，干血片中采集的样本量少，与相同的浓度的血清样本相比，干血片样本检测的响应强度低，对检测灵敏度要求更高。此外，干血片样本在保存和运输的过程中与空气的相对接触面积大，易受环境温度和湿度的影响，可能导致某些化学性质不稳定的药物发生降解。

4、现有技术中虽有基于干血片样本检测其中含有的胆汁酸、脂溶性维生素或25-羟基维生素d等的液相色谱串联质谱检测方法。但干血片样本中不同物质的提取和释放方法不同，当前公开的干血片样本的液相色谱串联质谱检测方法并不适用于干血片中精神类药物的检测。综上，开发一种样本释放率高、检测灵敏度好的检测干血片中精神类药物的方法及试剂盒，对精神类药物的tdm具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种干血片样本的前处理试剂盒及前处理方法，并在此基础上提供了一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种干血片样本的前处理试剂盒。

3、本发明的第二个目的是提供一种干血片样本的前处理方法。

4、本发明的第三个目的是提供所述前处理试剂盒或所述前处理方法在干血片中精神类药物的液相色谱串联质谱检测中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的试剂盒。

6、本发明的第五个目的是提供一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的方法。

7、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

8、本发明通过不断地优化，先构建了一种干血片样本的前处理试剂盒。利用所述前处理试剂盒可以进一步提高所测干血片样本中精神类药物的释放效率，提高液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的灵敏度。在此基础上，本发明还提供了一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法。利用所述试剂盒和方法，本发明不仅实现了对干血片样本中的舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林和伏硫西汀的定量检测，且检测限低，有利于上述精神类药物的监测。

9、本发明提供了一种干血片样本的前处理试剂盒，包括提取液和样本释放剂。

10、具体地，所述提取液由二甲基亚砜、三氯甲烷、甲酸和水组成，所述二甲基亚砜的体积百分比为5%～10%，三氯甲烷的体积百分比为5%～10%，甲酸的体积百分比为1%～10%，余量为水。

11、优选地，所述二甲基亚砜的体积百分比为5%～8%，三氯甲烷的体积百分比为5%～6%，甲酸的体积百分比为1%～5%，余量为水。

12、更优选地，所述二甲基亚砜的体积百分比为8%，三氯甲烷的体积百分比为6%，甲酸的体积百分比为5%，余量为水。

13、具体地，所述样本释放剂为甲醇或由甲醇和乙腈组成，所述甲醇和乙腈的体积比为1:0～1。

14、更具体地，所述甲醇和乙腈的体积比为1:0.1～1。

15、本发明还提供了一种干血片样本的前处理方法，所述方法为：先用所述提取液对干血片样本进行超声提取，再在超声提取后的溶液中加入所述样本释放剂进行提取，保留上清液。

16、具体地，所述干血片样本为孔径为3～6 mm的干血片样本孔片，数量为1～3片；所述提取液的体积为30～60 μl；所述样本释放剂的体积为100～150 μl。

17、具体地，所述超声提取的处理时间为1 min；超声条件为30 khz。超声处理结束后加入样本释放剂，振荡提取3～5 min。

18、具体地，本发明所述干血片为人全血滤纸干血片或人血清滤纸干血片。

19、本发明所述提取液可以对干血片样本中具有不同溶解性质的精神类药物成分起到初步萃取作用，通过在加入样本释放剂之前加入所述提取液，能够使样本中的药物充分释放出来。此外，所述提取液中加入了一定含量的甲酸，可以使药物初步酸化，增大其萃取效率，并且可以在后续的质谱分析中，在正离子扫描模式下进一步增强药物的质谱响应强度，提高检测的灵敏度。因此，本发明请求保护所述前处理试剂盒或所述前处理方法在干血片中精神类药物的液相色谱串联质谱检测中的应用。

20、本发明还提供了一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的试剂盒，其含有本发明所述的前处理试剂盒，还含有稳定剂、所检测的精神类药物的内标标准品和所检测的精神类药物的干血片标样及干血片质控品。

21、具体地，所述精神类药物包括舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林和伏硫西汀。

22、具体地，所述稳定剂由防腐剂proclin300、维生素c和聚乙二醇组成；所述proclin300、维生素c和聚乙二醇的体积比为1：10～20：1～1.2。

23、优选地，proclin300、维生素c和聚乙二醇的体积比为1：10：1。

24、具体地，所述维生素c的浓度为25 mg/ml。

25、具体地，所述内标标准品为所检测的精神类药物的氘代物。

26、更具体地，所述内标标准品为舒必利-d3、奋乃静-d4、氟伏沙明-d3、曲唑酮-d6、布南色林-d5和伏硫西汀-d8。

27、除上述试剂外，所述试剂盒中还含有流动相添加剂1和流动相添加剂2。

28、具体地，所述流动相添加剂1为乙酸铵；所述流动相添加剂2为甲酸。

29、可选地，所述试剂盒中还包括96孔板（如v型或u型底96孔板）、铝箔封口膜和操作说明书。

30、本发明所述试剂盒的相关应用也在本发明的保护范围内。如所述试剂盒在制备检测人全血滤纸干血片中舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林、伏硫西汀中的一种或几种精神类药物的产品中的应用。

31、作为一种可选的实施方案，本发明所述试剂盒中，所述所检测的精神类药物的干血片标样及干血片质控品可替换为所检测的精神类药物的标准品及滤纸。利用所述标准品和滤纸可以制备得到所述干血片标样及干血片质控品。

32、具体地，所述干血片标样及干血片质控品的制备方法如下：将含所检测的精神类药物的标准品与健康人全血混合均匀，制备得到人全血样本，用健康人全血将所述人全血样本稀释为所需浓度后滴至滤纸上晾干即可；所述健康人全血也可替换为健康人血清。

33、具体地，所述人全血样本的滴加体积为50～100 μl。

34、具体地，所述人全血样本中含有本发明所述稳定剂；所述稳定剂的质量为所用健康人全血体积的4～6%。

35、更具体地，所述稳定剂的质量为所用健康人全血体积的5%。

36、在干血片标样和质控品的制备过程中加入本发明所述稳定剂，可以使制备所得干血片标样和质控品在其长期保存的过程中保持稳定。本发明所述稳定剂中的多种成分联合作用，能够使血液或血清样本与滤纸片的吸附性增强，保持干血片样本基质的稳定，使样本中化学性质不稳定的药物不易发生氧化作用，使降解速度大大降低。

37、以检测精神类药物舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林和伏硫西汀的试剂盒为例。所述试剂盒中，精神类药物舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林和伏硫西汀的干血片标样包括空白样品和干血片标样c1～c7；其中，干血片标样c1上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 15 ng/ml、奋乃静 0.2 ng/ml、氟伏沙明 10 ng/ml、曲唑酮 20 ng/ml、布南色林 2 ng/ml、伏硫西汀 1 ng/ml；

38、干血片标样c2上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 30 ng/ml、奋乃静0.4 ng/ml、氟伏沙明 20 ng/ml、曲唑酮 40 ng/ml、布南色林4 ng/ml、伏硫西汀 2 ng/ml；

39、干血片标样c3上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 300 ng/ml、奋乃静4 ng/ml、氟伏沙明 200 ng/ml、曲唑酮 400 ng/ml、布南色林 40 ng/ml、伏硫西汀 20 ng/ml；

40、干血片标样c4上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 600 ng/ml、奋乃静8 ng/ml、氟伏沙明 400 ng/ml、曲唑酮 800 ng/ml、布南色林 80 ng/ml、伏硫西汀 40 ng/ml；

41、干血片标样c5上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 900 ng/ml、奋乃静12 ng/ml、氟伏沙明 600 ng/ml、曲唑酮 1200 ng/ml、布南色林 120 ng/ml、伏硫西汀 60ng/ml；

42、干血片标样c6上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 1800 ng/ml、奋乃静24 ng/ml、氟伏沙明 1200 ng/ml、曲唑酮 2400 ng/ml、布南色林 240 ng/ml、伏硫西汀120 ng/ml；

43、干血片标样c7上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 2250 ng/ml、奋乃静30 ng/ml、氟伏沙明 1500 ng/ml、曲唑酮 3000 ng/ml、布南色林 300 ng/ml、伏硫西汀150 ng/ml。

44、所述干血片质控品包括低、中、高浓度干血片质控品；其中，所述低浓度干血片质控品上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 45 ng/ml、奋乃静 0.6 ng/ml、氟伏沙明 30 ng/ml、曲唑酮 60 ng/ml、布南色林6 ng/ml、伏硫西汀 3 ng/ml；

45、所述中浓度干血片质控品上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 450 ng/ml、奋乃静 6 ng/ml、氟伏沙明 300 ng/ml、曲唑酮 600 ng/ml、布南色林 60 ng/ml、伏硫西汀 30 ng/ml；

46、所述高浓度干血片质控品上所含六种精神类药物的浓度分别为：舒必利 1500ng/ml、奋乃静20 ng/ml、氟伏沙明 1000 ng/ml、曲唑酮 2000 ng/ml、布南色林 200 ng/ml、伏硫西汀 100 ng/ml。

47、本发明还提供了一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的方法，所述精神类药物包括舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林和伏硫西汀；

48、具体地，所述方法包括以下步骤：

49、s1.干血片样本的前处理：用本发明所述前处理试剂盒中的样本释放剂分别对待测干血片样本、干血片标样及干血片质控品进行提取，保留上清液；或用本发明所述前处理方法分别对待测干血片样本、干血片标样及干血片质控品进行处理；在加样本释放剂前，先在所述样本释放剂中加入所检测的精神类药物的氘代物作为内标；

50、s2.干血片样本的定量检测：用液相色谱串联质谱法对步骤s1中提取得到的上清液进行定量检测分析。

51、具体地，步骤s2中，在利用样本释放剂进行处理前，先将内标干粉与样本释放剂按比例混合，使舒必利-d3内标的浓度为1000 ng/ml、奋乃静-d4内标的浓度为5 ng/ml、氟伏沙明-d3内标的浓度为300 ng/ml、曲唑酮-d6内标的浓度为500 ng/ml、布南色林-d5内标的浓度为100 ng/ml、伏硫西汀-d8内标的浓度为100 ng/ml。

52、具体地，步骤s2所用色谱条件为：色谱柱：agela durashell c8色谱柱；流动相：包括流动相a和流动相b；流动相a为含5 mmol/l乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液；流动相b为甲醇；柱温：40 ℃；样品池温度：8 ℃；进样体积：10 μl；洗脱方式为线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序如下表所示：

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54、质谱条件为：采用多反应监测（mrm）模式进行检测；负离子模式下，采用esi离子源，雾化气流量为3 l/min，加热气流量为10 l/min，干燥气流量为10 l/min，接口温度为350 ℃，dl温度为200 ℃；多反应监测的参数如下表所示，为定量离子对：

55、

56、本发明采用梯度洗脱的方式，加入乙酸铵和甲酸作为流动相添加剂，对于在色谱柱上弱保留的药物，如舒必利，可使其具有正态的峰形和较小的半峰宽，使定量测定具有较好的重复性和准确度。对于在色谱柱上后洗脱的组分如布南色林、伏硫西汀等，通过优化洗脱梯度，提高其质子化的效率，增强定量下限点的响应强度。

57、在此基础上，本发明通过优化离子源参数和质谱mrm扫描参数，使定量下限低、离子化效率低的药物的响应大大增强，使其能满足定量测定的要求。

58、本发明所述方法中还包括标准曲线的建立；具体如下：将干血片标样和质控样本随待测干血片样品同时处理，处理后用液相质谱联用仪进行分析；分别记录每个浓度的舒必利、奋乃静、氟伏沙明、曲唑酮、布南色林、伏硫西汀以及对应的内标物的峰面积，以上述各药物与对应的内标峰面积比值为纵坐标，以各药物对应的浓度为横坐标，线性回归得到各药物的标准曲线方程；将待测样本测定的各药物和对应的内标物的峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测干血片中各精神类药物的含量。

59、本发明具有以下有益效果：

60、为提高干血片中精神类药物的释放率，本发明首先提供了一种干血片样本的前处理试剂盒及前处理方法。在此基础上，本发明还提供了一种基于液相色谱串联质谱检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法。利用本发明所述前处理试剂盒及前处理方法，可使干血片样本中所含的精神类药物被充分释放，使后续检测的灵敏度大幅提高，即使是对色谱条件较为敏感的氟伏沙明、伏硫西汀以及布南色林，也能显著降低其定量下限。

61、此外，利用本发明所述前处理试剂盒及前处理方法对质控样本进行前处理时，对于不同批次的基质均有较高的提取效率，在面对临床病人样本个体间差异时，可使检测结果具有一致性，保证临床检测结果的准确度。