一种水包油乳液佐剂成分的检测方法与流程

本发明涉及一种水包油乳液佐剂成分的检测方法。

背景技术：

1、疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。佐剂有很多种，例如氢氧化铝佐剂、脂多糖、乳剂等，其中水包油乳液佐剂为近年来研究较多，备受关注的佐剂。

2、水包油乳液佐剂，其油相为具有免疫增强作用的动植物油脂或矿物油，如角鲨烯，加入吐温和司盘类化合物作为乳化剂。水相中还可能含有其他辅助剂，如缓冲剂等。

3、mf59佐剂是一款具有生物相容性的水包油乳液佐剂，其主要成分包括角鲨烯、聚山梨酯80和司盘85。其优点是稳定性好、毒副作用小。mf59佐剂的主要作用机制是细胞募集。当mf59佐剂在抗原之前或者与抗原共同注射机体时，mf59佐剂可以在注射部位创造一个免疫活性环境，诱导局部分泌趋化因子，招募免疫细胞从血液中汇集到注射部位，并且通过细胞内转运将一定数量的佐剂和抗原转移到局部引流淋巴结，加快对抗原的摄取和递呈。

4、mf59佐剂的研究始于20世纪90年代初，成为获批上市的第二种用于疫苗的佐剂，通过研究人员的不断努力，mf59佐剂已成功应用于人类疫苗。mf59佐剂具有安全性、有效性及高效性等优点，并在免疫机体后诱导产生持续的体液免疫，减少抗原使用量的同时也诱导了较高的抗体水平。

5、近年来，疫苗领域迎来了快速发展，同时也面临着更为严格的监管。与一般药品不同，疫苗主要用于预防，面向健康人群，婴幼儿是重要的接种人群，其质量直接关系着公众的生命安全。佐剂作为疫苗的重要组成部分，能够增强机体对抗原的免疫应答反应或改变免疫应答反应类型，延长疫苗在体内作用时间，提高疫苗效力。

6、mf59佐剂的研发及质量评价工作极具挑战性，对其所含主要成分角鲨烯、聚山梨酯80和司盘85的定量分析检测尤为重要。为此，对其相应的分析技术也提出了更高的要求。与mf59成分类似的as03佐剂也有类似需求。

7、jenny sun等采用反相色谱法测定gla-se佐剂中角鲨烯含量[jenny sun，richardl，analytical characterization of an oil-in-water adjuvant emulsion，aapspharmasic tech，2016]。该方法中色谱条件包括：色谱仪为agilent 1100(二元泵)，检测器为sedere型sedex75蒸发光散射检测器(alfortville，法国)，色谱柱为luna c8(150mm，4.6mm，5μm)，柱温为28℃，流动相a为50mmol/l乙酸钠(乙酸调ph至4)，流动相b为甲醇，流速为1ml/min。洗脱程序为梯度洗脱，0～1分钟流动相b占比保持90v％，1～13分钟流动相b占比由90v％变为97v％，13～20分钟流动相b占比保持97v％。下一针进样之前流动相b占比90v％维持5分钟。蒸发光散射检测器漂移管温度50℃，压力3.5bar，增益3。角鲨烯在17～18分钟出峰。但gla-se佐剂与mf59佐剂成分不同，不含mf59佐剂中所含的聚山梨酯80和司盘85，对mf59佐剂或as03佐剂中成分的分析检测方法不具参考性。

8、目前，亟需开发针对水包油乳液佐剂、尤其针对mf59佐剂或as03佐剂适用的分析检测方法，满足此类佐剂的研发及质量评价的需要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的水包油乳液佐剂的检测方法较少，尚无特别适于mf59佐剂成分的分析检测方法的缺陷，而提供了一种水包油乳液佐剂成分的检测方法。本发明的方法分离度高、准确度高、操作简单，可准确、快速检测水包油乳液佐剂成分、尤其mf59佐剂成分或as03佐剂成分。

2、本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：

3、本发明提供了一种水包油乳液佐剂成分的检测方法，其包括以下步骤：采用高效液相色谱法对含水包油乳液佐剂成分的样品进行分离检测，色谱条件包括：

4、色谱柱为c8色谱柱；

5、流动相a为水；流动相b为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种；

6、洗脱梯度包括：

7、 洗脱阶段 洗脱时长 流动相a 流动相b 1 15-25min 40-70v％降至≤0-20v％ 30-60v％升至80-100v％ 2 5-20min 保持0-20v％ 保持80-100v％

8、本发明中，所述水包油乳液佐剂成分可为水包油乳液佐剂中所含油脂类化合物和乳化剂中的一种或多种。

9、例如，所述水包油乳液佐剂成分为mf59佐剂成分，具体为角鲨烯、聚山梨酯80和司盘85中的一种或多种，更具体为角鲨烯、聚山梨酯80和司盘85中的两种或三种。

10、再例如，所述水包油乳液佐剂成分为as03佐剂成分，具体为角鲨烯、聚山梨酯80和生育酚中的一种或多种，更具体为角鲨烯、聚山梨酯80和生育酚中的两种或三种。

11、本发明中，含水包油乳液佐剂成分的样品可为水包油乳液佐剂成分标准品配制的标准样品，或待测水包油乳液佐剂样品。例如，所述含水包油乳液佐剂成分的样品为含mf59佐剂成分的样品，具体可为mf59佐剂成分标准品配制的标准样品，或待测mf59佐剂样品。再例如，所述含水包油乳液佐剂成分的样品为含as03佐剂成分的样品，具体可为as03佐剂成分标准品配制的标准样品，或待测as03佐剂样品。

12、其中，所述标准样品用于进行线性梯度浓度的检测，进而绘制标准曲线。实际待测样品经色谱检测后，基于标准曲线，计算得目标检测物在待测样品中含量。

13、本发明中，所述c8色谱柱的型号可为本领域常规各类c8色谱柱，优选agilentzorbax eclipse plus c8。

14、本发明中，所述c8色谱柱的规格可按常规选择。所述色谱柱的长度可为100-300mm，优选150-250mm，如100mm、150mm或250mm。所述色谱柱的内径可为1-8mm，优选3-6mm，如4.6mm。所述色谱柱中填料的粒径可为3.5-5μm，如3.5μm或5μm。较佳地，所述色谱柱的规格为：长度250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

15、本发明中，所述色谱柱的柱温可按本领域常规，具体可为35-60℃，优选50℃。

16、本发明中，所述洗脱梯度优选：

17、 洗脱阶段 洗脱时长 流动相a 流动相b 1 15-20min 45-55v％降至≤0-10v％ 45-55v％升至90-100v％ 2 5-20min 保持0-10v％ 保持90-100v％

18、更优选：

19、 洗脱阶段 洗脱时长 流动相a 流动相b 1 15-20min 50v％降至0v％ 50v％升至100v％ 2 10-20min 保持0v％ 保持100v％

20、最优选：

21、 洗脱阶段 洗脱时长 流动相a 流动相b 1 20min 50v％降至0v％ 50v％升至100v％ 2 15min 保持0v％ 保持100v％

22、其中，所述洗脱时长为该洗脱阶段的起点时间与终点时间的差值。

23、其中，所述升或降优选在所述洗脱时长内线性匀速上升或下降。

24、按常规，所述洗脱梯度还可进一步包括分离过程后的色谱柱洗脱阶段，使得样品分析后下针无残留：将流动相a即刻切换至40-70v％，优选至50v％，流动相b即刻切换至30-60v％，优选至50v％，并保持3-20min，优选保持5-10min。

25、本发明中，所述流动相的流速可按本领域常规，具体可为0.5-1.5ml/min，优选0.8ml/min。

26、本发明中，所述高效液相色谱法中，进样量可按本领域常规，具体可为5-20μl，优选10μl。

27、本发明中，所述反相高效液相色谱法采用本领域常规的色谱仪，优选岛津lc-2030c高效液相色谱仪。

28、本发明中，所述高效液相色谱法的检测器可按本领域常规，按适用于目标检测物进行选择。

29、例如，当目标检测物为角鲨烯时，所述检测器优选紫外检测器，具体可为紫外吸收检测器(uvd)或光电二极阵列检测器(pdad或dad)。所述紫外检测器的检测波可为200-250nm，优选210nm。

30、再例如，当目标检测物为聚山梨酯80和/或司盘85时，所述检测器优选蒸发光散射检测器(elsd)或示差折光检测器，具体如alltech elsd 3300hp。所述elsd检测器的运行参数可为：气体流速为1-2l/min，优选1.5l/min；漂移管温度为70-90℃，优选85℃，增益值为1。

31、较佳地，当所述样品为待测水包油乳液佐剂样品(如待测mf59佐剂样品或待测as03佐剂样品)时，可先进行破乳预处理。

32、本发明一优选实例中，目标检测物为角鲨烯，所述破乳预处理采用下述方式：将所述待测水包油乳液佐剂样品与硫酸钠混合，不振摇的条件下加入提取溶剂溶解上层液体，之后取所述提取溶剂层，稀释；所述提取溶剂为丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷或正己烷。

33、其中，所述硫酸钠优选无水硫酸钠。所述硫酸钠与所述待测水包油乳液佐剂样品的质量体积比可为3-6g/10ml，优选4g/10ml。

34、其中，所述混合的温度可为40-70℃，优选60℃。较佳地，采用水浴加热至所需温度。所述混合的时间可为0.5-2h，优选1h。

35、其中，所述提取溶剂优选分多次加入，优选分4-6次(如5次)加入。在所述加入提取溶剂溶解上层液体的过程中不振摇，是以免形成乳化层，造成无法提取。所述提取溶剂的量可为2-5ml/10ml样品，优选为2ml/10ml样品。

36、较佳地，将所述提取溶剂层还进一步进行提纯，具体如离心提纯。所述离心的转速可为1000-3000r/min，优选2500r/min。所述离心的时间可为5-10min，优选5min。

37、其中，所述稀释的倍数可为500-5000倍，优选1000倍。所述稀释的溶剂可为不影响色谱分析的常规溶剂，优选丙酮和乙醇的混合液，所述丙酮和乙醇的体积比优选1：1。

38、本发明又一优选实例中，所述破乳预处理采用下述方式：用异丙醇稀释所述待测水包油乳液佐剂样品，静置；所述稀释在所述静置前进行，或者在所述静置前和静置后分次进行。

39、当目标检测物为角鲨烯时，所述稀释的倍数可为500-5000倍，优选800-1500倍，最优选1000倍。

40、当目标检测物为聚山梨酯80时，所述稀释的倍数可为2-25倍，优选4-6倍，最优选5倍。

41、当目标检测物为司盘85时，所述稀释的倍数可为2.5-25倍，优选8-12倍，最优选10倍。

42、其中，所述静置的时间可为15～30min，优选15min。所述静置的温度可为0-10℃。

43、较佳的，所述静置后，再进行过滤提纯，取滤液。所述过滤前优选进行振摇。所述过滤优选采用孔径为0.45μm以下的滤膜，具体如0.22μm的聚醚砜(pes)材质滤膜。所述取滤液优选取初滤液之后的续滤液。所述初滤液的量一般可为滤液总体积的2-20％。

44、上述优选实例中，所述待测水包油乳液佐剂样品优选mf59佐剂或as03佐剂。

45、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

46、本发明所用试剂和原料均市售可得。

47、本发明的积极进步效果在于：本发明的检测方法适用于水包油乳液体系，并能兼顾排除其水相中所含其他成分(如缓冲盐等)的影响，对水包油乳液佐剂成分、尤其对mf59佐剂成分、as03佐剂成分，具体对角鲨烯、聚山梨酯80和司盘85具有优异的分离效果。本发明的检测方法准确度高，可实现快速、简便地检测，并且所用试剂毒性低，危害小，对环境友好，能满足水包油乳液佐剂的研发及质量评价中的定量分析检测需要。