检测细胞上清液中大分子化合物的方法与流程

本发明属于细胞培养检测领域，具体地，本发明涉及检测细胞上清液中大分子化合物的方法，更具体地，本发明涉及检测细胞培养上清液中胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf）的方法。

背景技术：

1、细胞在培养过程中，合理优化培养基的营养物成分非常重要，以促进细胞生长、延长培养时间并提高产物合成。胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf）是细胞培养中必需的物质，对细胞的生长、增殖和功能调节起着重要作用。

2、胰岛素是一种多肽类激素，具有调节血糖水平、细胞增殖以及糖、脂和蛋白质代谢等多种功能。在细胞培养中，胰岛素是必需的营养物质，对于细胞的正常生长和代谢至关重要。表皮生长因子和胰岛素样生长因子是特定受体上的生物活性因子，通过与受体结合调节细胞的生长、增殖、分化和功能。它们在培养液中起着重要的作用，促进体外细胞的增殖和功能表达。

3、由于不同类型的细胞和不同培养阶段的细胞对这些物质的需求量和最适添加量可能有所差异，因此在细胞培养过程中，对胰岛素、egf和igf的监控非常必要。通过监测它们的浓度变化，可以更好地了解它们对细胞生长、代谢和抗体合成的影响。

4、因此，亟需开发一种方法来检测细胞上清液中胰岛素、egf和igf的浓度。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

2、发明人发现，目前检测胰岛素（insulin）、egf和igf的检测方法主要有酶联免疫法和hplc方法。其中，酶联免疫法自动化和商品化程度高，对于不同基质样品，存在交叉反应，影响结果可靠性，而且价格昂贵，操作复杂耗时，不能实现一个试剂盒同时测定3种物质；hplc方法选择性好，但是灵敏度差。为了克服这一问题，发明人利用液相色谱串联质谱法检测细胞培养上清液中大分子化合物，准确地测定细胞培养上清液中3种大分子化合物胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf）的含量。该方法可实现同时检测细胞培养上清液中的胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf），并且该方法中的单个样本分析运行程序只需10min即可实现对单样本多指标的同步检测，具有灵敏度高、精密度好、准确性高、时间短和操作简单的优点。

3、基于此，本发明的第一个方面，本发明提出了一种检测细胞培养上清液中大分子化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用液相色谱串联质谱法对待检细胞培养上清液进行检测处理，以便获得液相色谱图和质谱图；以及基于所述液相色谱图和质谱图，确定所述待检细胞培养上清液中的大分子化合物的含量，其中，所述大分子化合物包括胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf）。根据本发明实施例的方法可实现同时检测细胞培养上清液中的胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf），并且该方法中的单个样本分析运行程序只需10min即可实现对单样本多指标的同步检测，具有灵敏度高、精密度好、准确性高、时间短和操作简单的优点。

4、本发明的第二个方面，本发明提出了一种检测细胞培养上清液中大分子化合物的方法。根据本发明的实施例，所述大分子化合物包括胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf）；

5、所述方法包括：

6、将所述大分子化合物分别通过加入5mmol/l的0.1%bsa盐酸溶液的稀释液进行配制处理，以便分别获得所述大分子化合物的标准品储备液，其中，胰岛素（insulin）标准品储备液浓度为0.877mg/l，表皮生长因子（egf）标准品储备液浓度为3mg/l，胰岛素样生长因子（igf）标准品储备液浓度为7.5mg/l；

7、将所述大分子化合物标准品储备液分别通过加入5mmol/l的0.1%bsa盐酸溶液的稀释液进行第一稀释处理，以便分别获得检出限样本和校准品样本；其中，胰岛素检出限样本的浓度依次为0.877ppb和87.7ppb；表皮生长因子检出限样本的浓度依次为30ppb、150ppb和300ppb；胰岛素样生长因子检出限样本的浓度依次为75ppb、750ppb和1500ppb；胰岛素校准品样本的浓度依次为0.05ppb、0.5ppb、1ppb、2.5ppb、5ppb和10ppb；表皮生长因子校准品样本的浓度依次为0.001ppm、0.005ppm、0.1ppm、0.25ppm、0.5ppm和1ppm；胰岛素样生长因子校准品样本的浓度依次为0.5ppm、0.75ppm、1ppm、1.5ppm和2ppm；

8、利用液相色谱串联质谱法对所述待检细胞培养上清液、检出限样本和校准品样本分别进行检测处理，以便获得所述待检细胞培养上清液、检出限样本和校准品样本的液相色谱图和质谱图；以及基于所述液相色谱图和质谱图，确定所述细胞培养上清液中的所述大分子化合物的含量；

9、其中，所述液相色谱串联质谱法中的液相色谱条件包括：

10、所述液相色谱的流动相a为体积分数为0.1%的甲酸水；

11、所述液相色谱的流动相b为体积分数为0.1%的甲酸乙腈；

12、所述液相色谱的柱温为40℃；

13、所述液相色谱的洗针液由体积分数为33.3%水，体积分数为33.3%乙腈，体积分数为33.3%甲醇和体积分数为0.2%乙酸组成；

14、所述液相色谱的流速为0.7ml/min；

15、所述液相色谱的洗脱梯度如下：

16、时间在0.00min时，流动相b在流动相中的体积分数为10%；

17、时间在0.2min时，流动相b在流动相中的体积分数为10%；

18、时间在3.7min时，流动相b在流动相中的体积分数为45%；

19、时间在4min时，流动相b在流动相中的体积分数为95%；

20、时间在4.4min时，流动相b在流动相中的体积分数为95%；

21、时间在4.5min时，流动相b在流动相中的体积分数为10%；

22、时间在4.8min时，流动相b在流动相中的体积分数为10%；所述液相色谱的色谱柱为phenomenex® kinetex®,2.6 µm,c18 column,3.0x50 mm；

23、所述液相色谱串联质谱法中的质谱条件包括：

24、所述质谱采用的参数包括：esi-离子源，扫描模式正模式，离子源温度650℃，离子源喷雾电压5500v，气帘气40psi，gas165psi，gas265psi；

25、在检测处理前进一步包括对质谱仪进行平衡处理，所述平衡处理可通过进样30针稀释液实现；

26、所述待检细胞培养上清液是通过将细胞培养上清液进行第二稀释处理后获得的，所述第二稀释处理的倍数为2。

27、根据本发明实施例的方法可实现同时检测细胞培养上清液中的胰岛素（insulin）、表皮生长因子（egf）和胰岛素样生长因子（igf），并且该方法中的单个样本分析运行程序只需10min即可实现对单样本多指标的同步检测，具有灵敏度高、精密度好、准确性高、时间短和操作简单的优点。

28、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。