本发明属于醛固酮的检测,具体涉及一种化学发光法检测醛固酮的试剂盒及应用。
背景技术:
1、醛固酮(ald)是由肾上腺皮质球状带分泌的一种盐皮质激素,分子量为360.4道尔顿。正常情况下,醛固酮(ald)的分泌受肾素-血管紧张素系统的调节。而当醛固酮分泌异常时,则预示着机体存在某些疾病或病变,比如:醛固酮增高多见于患有双侧肾上腺球状带增生、低钾血症、部分恶性高血压及缓进型高血压等疾病的患者,而醛固酮降低多见于患有肾上腺皮质功能减退、糖尿病,turner氏综合征,急性乙醇中毒等疾病的患者,因此,检测血清或血浆中醛固酮的含量对于疾病的诊断具有重要意义;
2、然而由于在人体内,醛固酮主要和血浆白蛋白结合,具有相对较短的半衰期(约35min)及较高的代谢清除率,如果检测时间耗时过长或者方法的检测限过高,都会导致醛固酮检测失败或检测结果不准确,从而影响疾病的诊断,因此,研发一种快速、高效、检测限低、准确度高的醛固酮的检测方法及试剂盒用于血清或血浆中醛固酮的检测显得至关重要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术中的的缺陷,提供了一种化学发光法检测醛固酮的试剂盒及应用,其检测耗时短、效率高,检测限低,准确度高,可以用于血清或血浆样品中醛固酮的定量检测。
2、为实现上述目的,本发明所采取的技术方案如下:
3、一种化学发光法检测醛固酮的试剂盒,包括酶标工作液、抗体工作液、磁珠工作液;
4、所述酶标工作液采用含有10-100ng/ml ald-ap的酶标缓冲液(含镁离子、锌离子、牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂),所述酶标缓冲液的ph为6.0,所述酶标缓冲液中还含有50mm mes基质;
5、所述抗体工作液采用含有20-200ng/ml ald-ab-biotin的抗体缓冲液(含牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂),所述抗体缓冲液的ph为7.4,所述抗体缓冲液中含有50mm tris基质。
6、所述磁珠工作液采用含有0.1-0.3 mg/ml链霉亲和素磁珠的磁珠缓冲液(含牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂),所述磁珠缓冲液的ph为7.4,所述磁珠缓冲液中含有50mm tris基质。
7、作为进一步的技术方案,所述ald-ap的制备方法,包括如下步骤:
8、步骤a、 ald的活化:将emch溶液加入至ald溶液中,室温200rpm震荡反应0.5-4h,获得emch活化的ald溶液;
9、步骤b、ap酶的活化: 向ap酶溶液中加入2-it溶液后,用缓冲溶液(ph8.0的pbs溶液)稀释并定容,室温200rpm震荡反应0.5-4h,获得2-it活化的ap酶溶液;
10、步骤c、偶联:将步骤a制备的emch活化的ald溶液,加入至步骤b制备的2-it活化的ap酶溶液中,室温200rpm震荡1-3h,得偶联后的溶液;
11、步骤d、脱盐:将步骤c制备的偶联后的溶液用15kda脱盐柱脱盐,1500g离心2min,收集离心后的溶液,即终产物ald-ap。
12、作为进一步的技术方案,所述ald-ap的制备方法,包括如下步骤:
13、步骤a、 ald的活化:称取1mg的ald,用1ml dmso溶解,制得ald溶液;再称取0.1mg的emch,用0.1ml的50mm ph7.4的pbs溶液溶解,制得emch溶液;将emch溶液加入至ald溶液中,室温200rpm震荡反应0.5-4h,获得emch活化的ald溶液;
14、步骤b、ap酶的活化:称取1mg的 2-it,用1ml的100mm ph8.0的pbs溶液溶解,配制成1mg/ml的2-it溶液;量取1mg ap酶溶液,加入5μl的浓度为1mg/ml的2-it溶液,用100mmph8.0的pbs溶液稀释并定容至200μl,室温200rpm震荡反应0.5-4h,获得2-it活化的ap酶溶液;
15、步骤c、偶联:取0.1ml的emch活化的ald溶液,加入至2-it活化的ap酶溶液中,室温200rpm震荡1-3h,得偶联后的溶液。
16、步骤d、脱盐:将步骤c获得的偶联后的溶液用15kda脱盐柱脱盐,1500g离心2min,收集离心后的溶液,即终产物ald-ap。
17、作为进一步的技术方案,所述ald-ab-biotin的制备,包括如下步骤:
18、步骤a、偶联:向ald抗体中加入生物素-nhs溶液,然后用50mm ph7.4的pbs 缓冲液稀释并定容,室温震荡反应2h,得偶联后的溶液;
19、步骤b、脱盐:将步骤a制备的偶联后的溶液用15kda脱盐柱脱盐,1500g离心2min,收集离心后的溶液,即目标产物ald-ab-biotin。
20、作为进一步的技术方案,所述ald-ab-biotin的制备,包括如下步骤:
21、步骤a、偶联:称取5mg生物素-nhs,用1ml dmso溶解,得到5mg/ml的生物素-nhs溶液;然后称取100μg ald抗体,加入2.5μl的生物素-nhs溶液,然后用50mm ph7.4的pbs 缓冲液稀释并定容至100μl,室温200rpm震荡反应2h,得偶联后的溶液;
22、步骤b、脱盐:将步骤a制备的偶联后的溶液用15kda脱盐柱脱盐,1500g离心2min,收集离心后的溶液,即目标产物ald-ab-biotin。
23、作为进一步的技术方案,所述酶标工作液的制备方法,包括:用50mm mes基质,ph6.0的酶标缓冲液将ald-ap稀释成10-100ng/ml,获得酶标工作液。
24、作为进一步的技术方案,所述抗体工作液的制备方法,包括:用50mm tris基质,ph7.4的抗体缓冲液将ald-ab-biotin稀释成20-200ng/ml,获得抗体工作液。
25、作为进一步的技术方案,所述磁珠工作液的配制方法,包括:用50mm tris基质,ph7.4的磁珠缓冲液(含牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂)将链霉亲和素磁珠稀释成0.1-0.3mg/ml,制得磁珠工作液。
26、作为进一步的技术方案,还包括校准品和质控品;
27、所述校准品采用校准品缓冲液配制不同浓度梯度的ald抗原溶液;
28、所述质控品采用质控品缓冲液配制高中低三个浓度的ald抗原溶液。
29、作为进一步的技术方案,所述校准品的配制方法,包括:用校准品缓冲液(含50mmtris、牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清)将ald抗原稀释成2000、1000、500、200、100、50、25、10、0pg/ml浓度,共9个浓度梯度的校准品溶液。
30、作为进一步的技术方案,所述质控品的配制方法,包括:用质控品缓冲液(含50mmtris、牛血清白蛋白、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清)将ald抗原稀释成高中低质控品溶液。
31、一种所述的试剂盒在血清或血浆中醛固酮含量检测中的应用。
32、作为进一步的技术方案,根据所述的应用,采用试剂盒检测血清或血浆中醛固酮含量的方法,包括如下步骤:
33、向50μl的血清或血浆样品溶液中,加入50μl的抗体工作液、50μl的磁珠工作液后,37℃孵育5min,然后再加入50μl 的酶标工作液,37℃孵育5min,洗涤,然后加入aps-5底物,采用化学发光法检测发光强度,并根据醛固酮浓度与发光强度的标准曲线,计算血清或血浆样品中醛固酮的含量。
34、本发明用emch(n-ε-马来酰亚胺己酸酰肼)活化ald引入马来酰亚胺基团、用2-it(traut's试剂)活化碱性磷酸酶(ap)引入巯基,然后利用马来酰亚胺与巯基的反应将活化后ald和ap酶偶联在一起。最后通过脱盐柱除去小分子,得到终产物ald-ap;再搭配链霉亲和素磁珠和生物素化ald抗体(ald-ab-biotin),制作成ald化学发光检测试剂盒。
35、本发明试剂盒及检测方法的各项性能指标优越,且其所采用的标记方法简单、易操作,反应条件温和,反应速度快,检测限低,不需要将ald先偶联bsa/ova,或者将ald分子改造成衍生物再进行标记,降低了因操作复杂导致的检测误差及人力成本的增加。
36、本发明采用脱盐柱进行试剂的纯化,相较于传统技术汇总的透析纯化技术而言,耗时短、几分钟即可完成,极大的提高了试剂盒的生产效率。