一种测定茯苓中10种三萜类成分含量的方法与流程

本发明涉及分析检测，具体的，涉及一种测定茯苓中10种三萜类成分含量的方法。

背景技术：

1、茯苓始载于《神农本草经》，被列为上品，是沿用千年的药食两用大宗中药材。茯苓为多孔菌科真菌茯苓 poria cocos (schw.) wolf的干燥菌核，味甘、淡，平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾宁心之功效，可用于调理和治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、心神不安等不适。茯苓被誉为“四时神药”，有“十药九茯苓”之称，2020年版《中国药典》中含茯苓的制剂就高达250多种，《古代经典名方目录（第一批）》中共收录100种方剂中含茯苓的方剂有25种，为万吨级大宗中药品种，被誉为除湿之“圣品”，健脾之“要药”，同时也是大量食品、保健品、化妆品、中兽药的重要原料，应用前景极为广阔。

2、茯苓中含有多种化学成分，有多糖类、三萜类、甾醇类、挥发油类、蛋白质等，茯苓的主要活性成分有两种，一种是三萜类，另一种是多糖类化合物。现代药理研究表明，茯苓有利尿、保肝、镇静、免疫调节等作用，还有抗菌、抗溃疡、降血糖的功效，且对中枢神经、免疫系统、消化系统等具有良好的保护作用。茯苓法定质量标准为《中国药典》2020年版一部，检验项目较简单，无含量测定项，无法全面真实地反映药材质量。通过市场调研和文献研究，发现茯苓的质量控制存在法定质量标准单一，无含量测定质控项目的问题。因此，建立了一种一测多评的测定茯苓中10种三萜类成分含量的方法十分必要，简便高效地对茯苓的质量控制提供依据。

技术实现思路

1、本发明提出一种测定茯苓中10种三萜类成分含量的方法，解决了相关技术中茯苓的质量控制存在法定质量标准单一，无含量测定质控项目的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提出一种测定茯苓中10种三萜类成分含量的方法，包括以下步骤：

4、s1、制备含去氢茯苓酸和茯苓酸的对照品溶液；

5、s2、制备含茯苓的供试品溶液；

6、s3、采用高效液相色谱法分别对所述对照品溶液和所述供试品溶液中的10种三萜类成分含量进行测定；

7、所述三萜类成分为茯苓酸b、去氢土莫酸、茯苓酸a、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸、土莫酸、3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸和茯苓酸。

8、作为进一步的技术方案，所述对照品溶液和供试品溶液的溶剂各自独立地为甲醇。

9、本发明中采用甲醇溶剂提取的三萜类成分含量最高，且峰形好，杂峰较少，更容易滤过。

10、作为进一步的技术方案，步骤s2中，所述制备时采用超声混合、回流混合、振摇混合中的一种。

11、作为进一步的技术方案，当所述制备采用超声混合时，所述制备时采用超声混合，所述超声混合的时间为15~45min，功率为400~500w，频率为40~50khz。

12、作为进一步的技术方案，步骤s2中，所述供试品溶液中，茯苓和溶剂的质量体积比为为1g:10~15ml。

13、作为进一步的技术方案，步骤s3中，所述高效液相色谱法的检测条件包括：流动相由a相和b相组成，a相为乙腈，b相为体积分数为0.1%的磷酸溶液，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：

14、0~5min，a相的体积分数由53%升至55%，b相的体积分数由47%降至45%；

15、5~10min，a相的体积分数由55%升至65%，b相的体积分数由45%降至35%；

16、10~12min，a相的体积分数由65%升至85%，b相的体积分数由35%降至15%；

17、12~15min，a相的体积分数由85%升至90%，b相的体积分数由15%降至10%。

18、本发明中设置的梯度洗脱条件具有洗脱时间短，高效洗脱的优势，进一步提高了检测茯苓中10种三萜类成分含量的精确度。

19、作为进一步的技术方案，所述高效液相色谱法的检测条件还包括采用c18色谱柱，尺寸2.1×100mm，填料粒径1.7µm，流速0.4ml/min，柱温为30℃。

20、本发明中，采用填料粒径1.7µm，尺寸2.1×100mm的c18色谱柱，茯苓样品的色谱峰和杂质峰分离的更好，峰形不拖尾，对茯苓样品的分析时间更短。

21、作为进一步的技术方案，高效液相色谱法的检测波长为：茯苓酸b、去氢土莫酸、茯苓酸a、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸和松苓新酸的检测波长为242nm，土莫酸、3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸和茯苓酸的检测波长为210nm。

22、本发明中采用的双波长，建立了一种一测多评-双波长联用的超高效液相色谱方法可测定茯苓中10种三萜类成分含量，简便高效地对茯苓的质量控制提供依据。

23、作为进一步的技术方案，所述高效液相色谱法的检测结果确定茯苓中10种三萜类成分含量的方法为：

24、a1、以去氢茯苓酸相应的峰为s1峰，计算茯苓酸b、去氢土莫酸、茯苓酸a、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、松苓新酸的相对保留时间后，分别乘以校正因子，计算得到茯苓酸b、去氢土莫酸、茯苓酸a、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸的含量；

25、a2、以茯苓酸相应的峰为s2峰，计算土莫酸、3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸的相对保留时间后，分别乘以校正因子，计算得到土莫酸、3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、茯苓酸的含量。

26、作为进一步的技术方案，所述茯苓酸b的相对保留时间为0.36，校正因子为1.04；所述去氢土莫酸的相对保留时间为0.38，校正因子为1.02；所述茯苓酸a的相对保留时间为0.48，校正因子为1.09；所述猪苓酸c的相对保留时间为0.57，校正因子为0.94；所述3-表去氢土莫酸的相对保留时间为0.65，校正因子为1.00；所述去氢茯苓酸的相对保留时间为1.00，校正因子为1.00；所述松苓新酸的相对保留时间为1.15，校正因子为0.93；所述土莫酸的相对保留时间为0.39，校正因子为0.98；所述3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸的相对保留时间为0.90，校正因子为0.82；所述茯苓酸的相对保留时间为1.00，校正因子为1.00。

27、本发明的工作原理及有益效果为：

28、1、本发明中，采用高效液相色谱法测定茯苓中三萜类成分含量，可同时检测10种三萜类成分，在制备供试品溶液时对茯苓采用超声提取的方法，与回流提取和振摇提取相比，操作更简单便捷，利用本发明的方法检测茯苓中10种三萜类成分具有重复性好，检测时间短，简单高效的优势，高效对茯苓的质量控制提供了依据。

29、2、本发明构建了茯苓三萜类成分的一测多评检测方法，以去氢茯苓酸和茯苓酸对照品为参照，分别确定去氢茯苓酸与茯苓酸b、去氢土莫酸、茯苓酸a、猪苓酸c、3-表去氢土莫酸、松苓新酸之间的相对校正因子以及茯苓酸与土莫酸、3-o-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、茯苓酸之间的校正因子，可以有效检测出茯苓中10种三萜类成分的含量，不仅降低了检测成本，还提高了检测效率，且通过一测多评法和外标法测定结果基本一致，测定结果准确，方法重复性好，耐用性好。