一种单分子检测免疫分析仪光学系统的制作方法

本技术涉及单分子检测免疫分析仪的光学系统领域。

背景技术：

1、单分子检测，其检测灵敏度可达fg级别，是传统elisa的1000倍。

2、检测的生物学原理是经典的免疫反应-双抗夹心法，磁珠上包被超过10*5数量级捕获抗体，捕获抗体捕获待测样本中的抗原，然后与加入的荧光染料标记的检测抗体形成双抗夹心结构，即结合相。因磁珠具有磁性，所以可以方便的利用磁分离的方式将上清液中的杂质去掉。

3、利用流式细胞术鞘流聚焦的方法进行检测是常用的检测方法之一，检测磁珠的前向散射光信号和抗体上标记的荧光染料被激光激发产生的荧光信号。磁珠的前向散射光信号用来计数，荧光信号用来判定磁珠是否形成了双抗夹心的结合相，形成双抗夹心的结合相即为阳性磁珠，否则为阴性磁珠。

4、待测样本中的抗原浓度为fg级别时，只有不超过5%的磁珠能捕获到抗原，形成双抗夹心的结合相。利用泊松分布理论计算出阳性磁珠对应的抗原蛋白浓度值，实现数字化fg级别的超高灵敏度检测。

5、待测样本中的抗原浓度较高时，大部分的磁珠都能捕获到抗原形成双抗夹心的结合相。此时荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，从而能建立标准曲线。通过对一定数量的磁珠进行检测，可以对待测抗原浓度进行定量测量。

6、利用专门开发的磁珠试剂系统，在现有的流式细胞仪或流式荧光分析仪上进行检测，其检测灵敏度也有望达到fg级别。如conniewu，tylerj.dougan，和davidr. walt等人发表的名称为“high-throughput, high-multiplex digitalprotein detection withattomolar sensitivity”的文章，在贝克曼库尔特公司生产的型号为cytoflexlx流式细胞仪上进行检测，灵敏度达到了fg级别，实现了单分子级别的检测灵敏度。

7、但是流式细胞仪或流式荧光分析仪的光学系统，其激光的方向与荧光收集的方向一般是垂直的，几乎所有的流式细胞仪光学系统都是这样设计的。原因为流式细胞仪或流式荧光分析仪一般需要多个荧光通道，物镜的数值孔径（na）也要求比较大，数值孔径达到1.2是比较理想的值。待测物以细胞为主，细胞的表面抗原数量很多，大部分细胞也有一定的透光性，所以流式细胞仪的激光方向与荧光收集方向垂直是有利于光学系统设计的，而如果是其它方式如平行的话则难度会非常大，多激光流式细胞仪的难度还会再提升一个级别。

8、这样的光学系统在检测磁珠时有如下的缺点：因目前所用的磁珠基本不透光，低浓度时每个磁珠上大概率只会形成一个双抗夹心的结合相，极低的概率可以形成2个，检测抗体上标记的荧光染料被激光照射到的概率为50%，产生的荧光被物镜收集到的概率也为50%，综合下来只有25%的概率会被判定为阳性磁珠（既被激光照射到，同时又被物镜收集到）。其它情形则不能保证一定会被识别为阳性磁珠。

9、高浓度时（比fg级别高1-2个数量级），每个磁珠上大概率至少形成一个双抗夹心的结合相，可能存在多个，但数量不会太多。此时建立标准曲线的依据是荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，结合相多，则荧光强度应该越大，但传统流式细胞仪的光学系统还是不能保证激光能荧光强度的均一性。磁珠表面双抗夹心的结合相数量越多，均一性越好。

10、这样就导致最终检测结果的变异系数（cv）是比较大的，不管是低浓度时还是高浓度时均是如此。因此，如何优化现有设备，实现更加全面、更加准确的检测就成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本实用新型针对以上问题，提出了一种单分子检测免疫分析仪光学系统，在主要和昂贵的物料如激光器和单光子探测器的使用数量不增加的情况下（数量均为1个），通过2个分光镜和1个衰减片将激光束分成强度相等的3束，分别从3个方向照射待测物（即磁珠），同时进行荧光的收集。

2、本实用新型的技术方案为：所述光学系统包括用于产生激光的激光光路、用于收集前向散射光的前向散射光检测通道以及用于收集荧光的荧光检测通道；

3、所述激光光路包括激光器100、分光镜a211、分光镜b212以及衰减片220，所述分光镜a211和分光镜b212依次固定安装在激光器100的一侧，先通过分光镜a211将激光器100发出的激光一分为二，再通过分光镜b212将经过的激光再次一分为二，使得激光器100发出的激光经过分光镜a211和分光镜b212后形成激光束a、激光束b，而经过分光镜a211分出的激光则形成激光束c，所述衰减片220固定设置在激光束c的路径上；

4、在激光束a的路径上固定设置用于透射激光的二向色滤光片a231，在激光束b的路径上固定设置激光反射镜b202以及用于反射激光的二向色滤光片b232，在激光束c的路径上固定设置激光反射镜c203以及用于反射激光的二向色滤光片c233，从而使得激光束a、激光束b、激光束c可以从三个不同的方向照射流动池300；

5、所述二向色滤光片a231透射激光的同时反射荧光，所述二向色滤光片b232、二向色滤光片c233反射激光的同时透射荧光，所述荧光检测通道具有三个，三个荧光检测通道分别接收二向色滤光片a231反射或二向色滤光片b232、二向色滤光片c233透射的荧光，并且三个荧光检测通道的末端连接同一个光纤向外输出荧光信号；

6、所述前向散射光检测通道与激光束a、激光束b或激光束c三者中的一个沿流动池300对称设置。

7、其中，在所述二向色滤光片a231和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜a241；

8、在所述二向色滤光片b232和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜b242；

9、在所述二向色滤光片c233和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜c243。

10、进一步的，所述前向散射光检测通道与激光束a经消色差透镜a241聚焦的激光束沿流动池300对称设置；

11、所述激光束b、激光束c经过反射后从两个不同的方向照射流动池300，并且消色差透镜b242和消色差透镜c243之间具有夹角，从而使得激光束b、激光束c分别经过消色差透镜b242、消色差透镜c243之后的中心光束之间具有夹角，从而使得经激光束c的逆向光路不能最终到达激光器内部，同时激光束c经流动池300后，经激光束b的逆向光路也不能最终到达激光器内部。

12、进一步的，所述激光束a、激光束b、激光束c聚焦后照射在流动池300的束腰位置重合或在三个束腰位置之间留有间距。

13、关于荧光检测通道；

14、三个所述荧光检测通道分别为设在二向色滤光片a231一侧的荧光检测通道a、设在二向色滤光片b232一侧的荧光检测通道b以及设在二向色滤光片c233一侧的荧光检测通道c；

15、荧光检测通道a自二向色滤光片a231所在的一侧起依次包括同光轴的带通滤光片a521、光纤耦合透镜a531及光纤a541，使得流动池300产生的荧光照射在二向色滤光片a231时会被反射，后透射过带通滤光片a521，并经光纤耦合透镜a531聚焦，最终耦合进光纤a541；

16、荧光检测通道b自二向色滤光片b232所在的一侧起依次包括同光轴的带通滤光片b522、光纤耦合透镜b532及光纤b542，使得流动池300产生的荧光照射在二向色滤光片b232时会直接透射，后透射过带通滤光片b522，并经光纤耦合透镜b532聚焦，最终耦合进光纤b542；

17、荧光检测通道c自二向色滤光片c233所在的一侧起依次包括同光轴的带通滤光片c523、光纤耦合透镜c533及光纤c543，使得流动池300产生的荧光照射在二向色滤光片c233时会直接透射，后透射过带通滤光片c523，并经光纤耦合透镜c533聚焦，最终耦合进光纤c543；

18、所述光纤a541、光纤b542、光纤c543和另外一根光纤d通过高温熔接的方式连接在一起，并且光纤d连接在单光子计数器的光纤接口上。

19、关于前向散射光检测通道；

20、所述前向散射光检测通道自流动池300所在的一侧起依次包括同光轴设置的挡片410、凸透镜a420、凸透镜b430以及探测器440，所述凸透镜a420和凸透镜b430相对设置，通过凸透镜a420收集流动池300发出的前向散射光信号并将光束准直，通过凸透镜b430将凸透镜a420准直后的前向散射光汇聚到探测器440上。

21、如图1-3所示，激光器100发出的激光束经激光反射镜a201时被反射，方向折转90度。激光束依次经过分光镜a211和分光镜b212，激光束被分成3束。

22、分光镜a211和分光镜b212在激光波长处的分光比例为50:50，衰减片220在激光波长处的衰减为50%，这样，3束激光束的能量基本是一样的。

23、定义透过分光镜a211和分光镜b212的激光束为激光束a。

24、定义透过分光镜a211但被分光镜b212反射的激光束为激光束b。

25、定义被分光镜a211反射，经激光反射镜c203反射，被衰减片220衰减的激光束为激光束c。

26、二向色滤光片a231为短波通滤光片，起始响应波长在激光波长和荧光波长之间，激光束a经二向色滤光片a231时会透射，经消色差透镜a241聚焦，其束腰位置与消色差透镜a241的焦点位置重合，均位于流动池，也即观察室300的内部流动中心位置。

27、二向色滤光片b232为长波通滤光片，起始响应波长在激光波长和荧光波长之间，激光束b先被激光反射镜b202反射，经二向色滤光片b232也会被反射，经消色差透镜b242聚焦，其束腰位置与消色差透镜b242的焦点位置重合，均位于流动池，也即观察室300的内部流动中心位置。

28、二向色滤光片c233为长波通滤光片，起始响应波长在激光波长和荧光波长之间，激光束c经二向色滤光片c233时会被反射，经消色差透镜c243聚焦，其束腰位置与消色差透镜c243的焦点位置重合，均位于流动池，也即观察室300的内部流动中心位置。

29、二向色滤光片a231也可以为长波通滤光片，二向色滤光片b232和二向色滤光片c233也可以为短波通滤光片。

30、消色差透镜a241、消色差透镜b242和消色差透镜c243，为激光光路和荧光光路共用，由冕牌玻璃和火石玻璃胶合而成，用来聚焦激光束，同时收集激光激发的荧光信号。其焦距在10mm-100mm之间，数值孔径na在0.05-0.65之间。消色差透镜也可以用球面单透镜或非球面透镜替代。

31、流动池，也即观察室300，其外部形状为方形或圆形，内部孔道形状为方向或圆形。待测物，即磁珠310从其内部孔道通过，经过激光束时产生前向散射光信号，其上的荧光物质也会被激光激发产生荧光。

32、前向散射光信号用于对磁珠进行计数。

33、凸透镜a420，用于收集激光束a产生的前向散射光信号并将光束准直。

34、挡片410位于凸透镜a420和流动池300之间，用于遮挡未被磁珠散射的激光本底信号。

35、凸透镜b430，用于将凸透镜a420准直后的前向散射光汇聚到探测器440上。

36、探测器440，将前向散射光信号转化为电信号，输出给电子系统。

37、激光束a，激光束b和激光束c，经消色差透镜聚焦后的束腰位置，在垂直方向上如图1，垂直于纸面方向可以是重合的，也可以是有一定间隔的，间隔距离一般为几十微米到几百微米之间，具体的间隔距离应能保证激光束a激发的荧光最终不会到达光纤b和光纤c内，激光束b激发的荧光最终不会到达光纤a和光纤c内，激光束c激发的荧光最终不会到达光纤a和光纤b内。

38、3束激光的束腰位置可以是重合的，这种方式的优点是可以100%的识别阳性磁珠，不管磁珠是否旋转。而且信号同步的，没有延迟，缺点是磁珠被3束激光同时照射，磁珠自身的荧光背景被放大，系统的信噪比会降低。

39、3束激光的束腰位置也可以是在垂直方向上有一定间隔的，这种方式的优点是磁珠自身的荧光背景不会被放大，缺点是会产生3个荧光信号，而且信号是不同步，有一定的延迟，需要增加信号延迟校准的步骤。此种情况下，如果磁珠本身是不旋转的，也可以100%的识别阳性磁珠。如果磁珠本身是旋转的，则有可能出现阳性磁珠在经过3束激光束的束腰位置时，其上的荧光物质都处在激光照射的背面。发生此种情况的概率经计算，理论上为不超过12.5%，阳性磁珠的检出率依然超过87.5%，对比现有技术仍有很大的提升。

40、激光束b透射消色差透镜b242之后的中心光束与激光束c透射消色差透镜c243之后的中心光束不是平行的，有一个小角度的夹角，具体可以通过如下两种方式均可以实现此小角度的夹角，方式一：消色差透镜b242和消色差透镜c243相对于流动池300有一个小角度的倾角；方式二：激光束有一定的倾角入射到消色差透镜b242和消色差透镜c243上。此角的大小设置为：激光束b经流动池300后，经激光束c的逆向光路不能最终到达激光器内部，同时激光束c经流动池300后，经激光束b的逆向光路也不能最终到达激光器内部。

41、激光器发出的激光束如果最终又传输回了激光器的内部，有可能造成激光器功率的不稳定或其它异常，虽然并不是必然发生异常，但也应尽量避免。

42、当待测物，即磁珠310经过激光束a的束腰位置时，其上标记的荧光物质被激光激发，产生的荧光会向360度立体空间发射，部分荧光被消色差透镜a241收集并准直，荧光传输到二向色滤光片a231时会被反射，经荧光反射镜a511再次被反射、透射过带通滤光片a521、经光纤耦合透镜a531聚焦，最终耦合进光纤a541。

43、荧光反射镜a511可以不设置，整个光学系统的长宽尺寸可能会变大。

44、当待测物，即磁珠310经过激光束b的束腰位置时，其上标记的荧光物质再次被激光激发产生荧光，部分荧光被消色差透镜b242收集并准直，荧光传输到二向色滤光片b232时会透射过去，经荧光反射镜b512反射，透射过带通滤光片b522、经光纤耦合透镜b532聚焦，最终耦合进光纤b542。

45、荧光反射镜b512可以不设置，整个光学系统的长宽尺寸可能会变大。

46、当待测物，即磁珠310经过激光束c的束腰位置时，其上标记的荧光物质依然会被激光激发产生荧光，部分荧光被消色差透镜c243收集并准直，荧光传输到二向色滤光片c233时会透射过去，经荧光反射镜c513反射，透射过带通滤光片c523、经光纤耦合透镜c533聚焦，最终耦合进光纤c543。

47、荧光反射镜c513可以不设置，整个光学系统的长宽尺寸可能会变大。

48、待测物，即磁珠310通过激光束束腰位置的顺序可以任意的，可以是a、b、c， a、c、b，b、a、c，b、c、a，c、a、b，c、b、a中的任意一种。

49、光纤a541、光纤b542、光纤c543和另外一根光纤d通过高温熔接的方式连接在一起，实现了同波长合束，通过调整光纤的数值孔径和纤芯直径，虽然传输效率还有一定的损失，但依然能保证超过90%以上的传输效率。

50、光纤a541、光纤b542、光纤c543为输入端，用于接收荧光。

51、输出端为光纤d，光纤d连接在单光子计数器的光纤接口上。

52、本实用新型中只有一个激光器和单光子探测器，在主要和昂贵的物料不增加数量的前提下，只要有任意一束激光能照射到磁珠上的荧光物质并收集到产生的荧光，即可判定为阳性磁珠，通过这种方式，极大的提高了阳性磁珠的识别率，达到降低最终测试结果变异系数（cv）的目的，实现了阳性磁珠识别率提升的效果。

53、本实用新型不是仅仅通过简单的增加荧光检测通道数量的方式来提高测试结果的准确度，更重要的是，本实用新型通过对结构的优化，还增加了照射在流动池上激光束的数量，使得流动池可以从更加广泛的角度接受激光的照射，从而在检测阳性磁珠时，可以提高阳性磁珠上的荧光物质被激光照射到的概率，同时产生的荧光也能同步被收集到。并且，本实用新型通过结构优化使得照射在流动池上激光束能量基本相同，多路激光束的逆向光路也不会返回激光器，实现了一个激光器和一个单光子探测器就能够极大提高阳性磁珠识别率的目的。