尿液样本的外泌体的富集系统

本技术涉及外泌体富集器械，尤其涉及一种尿液样本的外泌体的富集系统。

背景技术：

1、外泌体，英文名exosome，是一种参与生命活动和疾病发生机制的小于细胞的囊状结构，由各种细胞分泌，其外膜为脂质双层结构，直径为30～200nm(纳米)。外泌体于1983年就被发现，初期一直被认为是细胞废弃物，但随后的研究发现这种微小膜泡是生命活动和疾病发生的重要载体，不同细胞分泌的外泌体含有不同蛋白、脂质和核酸，外泌体将这些信号分子传递给靶细胞，发挥基因调控、蛋白表达、代谢调节和其他细胞功能。经国内外大量研究发现，外泌体参与正常和异常免疫反应中抗原呈递和免疫调控、抑制或促进肿瘤生长与迁移、改善或促进组织损伤等。由于疾病时不同细胞分泌的外泌体具有不同蛋白、核酸和脂肪成分，因此检测外泌体含有的各种成分可作为疾病诊断的生物标志物。

2、尽管外泌体已成为国际检测和临床研究的一个新型热点，特别是它在体内存在的广泛性和获取的便捷性，已经成为国际上医学领域研究疾病诊断、治疗新途径和新方法的重点和特点。由于其广泛参与生命活动和疾病发病机制，研发外泌体分离富集方法，从中检测分子标志物，在精准医学发展上有着光明的前景。

3、尽管尿液作为一种无创检测标本来源，一直都受到广泛研究，但由于尿液中多数是水分，而且有众多体内排除的代谢产物，特别是尿液中一种像芦苇荡一样的蛋白质，它们将尿液中的外泌体包裹其中，常规方法很难有效分离尿液外泌体。

4、目前国内外报道分离外泌体的主要方法是超速离心法。超高速离心分离提取尿液外泌体步骤:

5、1、17000xgcentrifugation(离心力为17000xg进行离心分离):分离细胞，大的细胞碎片：

6、1.1、17000xgfor10minat37℃(进行离心分离，离心力为17000xg，温度为37℃、分离时间为10分钟)；

7、1.2、保留上清液，这是上清液1；

8、1.3、用分离液沉淀重悬(根据沉淀的多少加入适量分离液)，往沉淀悬液中加入dtt，使其终浓度为200mg/ml；

9、1.4、37℃水浴沉淀悬液for5-10min(时间为5～10分钟)，每隔1-2min(1～2分钟)涡旋一次，直至沉淀完全溶解；

10、1.5、将沉淀悬液转移至离心管，17000xgfor10minat37℃(进行离心分离，离心力为17000xg，温度为37℃、分离时间为10分钟)，收集上清液2。

11、2、200000xg centrifugation(离心力为200000xg进行离心分离):使外泌体沉淀：

12、2.1、将上清液1和上清液2收集到一起，在离心力为200000xg下温度为37℃离心1h(1小时)；

13、3、resuspensionofextracellularvesicles(重悬外泌体)

14、3.1、将上清丢弃

15、3.2、用pbs(phosphate buffer saline,磷酸缓冲盐溶液)重悬外泌体。

16、超速离心法需要的超速离心机价格昂贵，一般只有著名大学、部分科研机构、部分发达地区的三甲医院拥有，使得这一方法使用受限；其次，该方法一次处理样本量有限。

17、综上所述，现有的结构在实际使用上，显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

技术实现思路

1、针对上述的缺陷，本实用新型的目的在于提供一种尿液样本的外泌体的富集系统，成本低，结构简单，并且很好的保持了外泌体自身的物理和化学特性。

2、为了实现上述目的，本实用新型提供了一种尿液样本的外泌体的富集系统，包括第一滤过器、第二滤过器、加压器以及外泌体收集容器；

3、所述第一滤过器的底部设置有第一滤过膜，所述第一滤过膜的截留直径大于所述外泌体的直径；所述第一滤过器开设有尿液样本入口以及第一加压接口；所述第一加压接口与所述加压器连接；

4、所述第二滤过器套设于所述第一滤过器的外侧，所述第二滤过器的底部设置有第二滤过膜；所述第二滤过膜的截留直径小于所述外泌体的直径；所述第二滤过器开设有第二加压接口；所述第二加压接口与所述加压器连接；所述第二滤过器的底部开设有外接口，所述外接口与所述外泌体收集容器连接。

5、根据所述的富集系统，还包括废液收集容器，其连接于所述第二滤过器的底部；

6、所述尿液样本入口上设置有密封盖；

7、所述第一滤过器、第二滤过器、加压器、外泌体收集容器以及废液收集容器构成密闭空间。

8、根据所述的富集系统，所述第一滤过膜的截留直径为200纳米；

9、所述第二滤过膜的截留直径为30纳米。

10、根据所述的富集系统，所述第一滤过膜以及所述第二滤过膜为纳米陶瓷膜。

11、根据所述的富集系统，所述第一滤过器的底部呈倒圆锥状；所述第一滤过膜附着于所述第一滤过器的底部的内壁上；

12、所述第二滤过器的底部呈漏斗状，包括斗部和管部；所述第二滤过膜附着于所述斗部的内壁上；所述外接口设置于所述管部的下端。

13、根据所述的富集系统，所述管部与所述外泌体收集容器之间设置有阀门；

14、所述第一滤过器的底部设置为多孔的筛网；

15、所述第二滤过器的底部的斗部设置为多孔的筛网。

16、根据所述的富集系统，所述加压器包括加压泵、第一压力输送管以及第二压力输送管；所述加压泵与所述第一压力输送管以及所述第二压力输送管连接；所述第一压力输送管与所述第一加压接口连接；所述第二压力输送管与所述第二加压接口连接。

17、根据所述的富集系统，还包括用于盛放所述尿液样本的容纳瓶，所述容纳瓶由透明材质制成；所述容纳瓶的外部设置有刻度线；所述容纳瓶的容量为2000毫升；

18、所述第一滤过器的底部的深度大于5厘米；

19、所述第二滤过器的底部的斗部的深度大于5厘米；

20、所述外泌体收集容器的容量大于5毫升。

21、根据所述的富集系统，所述外泌体收集容器呈圆柱状；所述外泌体收集容器由透明材质制成。

22、根据所述的富集系统，所述废液收集容器呈圆柱状；所述废液收集容器由透明材质制成；所述废液收集器的下部的侧壁设置有废液出口。

23、本实用新型的尿液样本的外泌体的富集系统包括第一滤过器、第二滤过器、加压器以及外泌体收集容器；所述第一滤过器的底部设置有第一滤过膜，所述第一滤过膜的截留直径大于所述外泌体的直径；所述第一滤过器开设有尿液样本入口以及第一加压接口；所述第一加压接口与所述加压器连接；所述第二滤过器套设于所述第一滤过器的外侧，所述第二滤过器的底部设置有第二滤过膜；所述第二滤过膜的截留直径小于所述外泌体的直径；所述第二滤过器开设有第二加压接口；所述第二加压接口与所述加压器连接；所述第二滤过器的底部开设有外接口，所述外接口与所述外泌体收集容器连接。尿液样本经过第一滤过器以及第二滤过器的两次滤过过程，提高了外泌体的富集纯度，加压器用于增加第一滤过器以及第二滤过器的内部的压力，提高了滤过过程的速度，提升了滤过的效率。