一种可用于蛋白质从头测序的肽段两末端等重同位素标记方法

本发明涉及了一种可用于蛋白质从头测序的肽段两末端等重同位素标记方法。

背景技术：

1、蛋白质是细胞生物的功能执行者，在生命活动中发挥着重要作用。对蛋白质进行测序对于研究蛋白质结构和功能至关重要。在目前主流的基于质谱对蛋白质进行测序的方法中，质谱数据的解析直接影响测序的结果。尽管目前有些物种已被建立基于基因组翻译得到的蛋白质组数据库，通过搜库的方法可以对这类生物的蛋白质组质谱数据解析。但是，许多物种仍然没有可供检索的完整蛋白质组数据库，此外，即使针对有完整蛋白质组数据库的物种，由基因突变或重组产生的蛋白质由于不在数据库中，因此也无法被检索到。针对以上情况，非常有必要发展不依赖于数据库的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。肽段的从头测序方法通过计算二级谱图中碎片离子的质量差异，确定氨基酸残基的类型，进一步推导出肽段的序列。然而质谱在进行质量分析时，不可避免地会产生噪音以及干扰离子，此外，由于从原始谱图中无法直接区分肽段的碎片b/y离子，因而限制了从头测序的发展，使准确地进行从头测序变得异常困难。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何提高肽段从头测序的易行性和准确度。

2、为了解决上述问题，本发明提供了用于蛋白质从头测序的肽段两末端标记的方法。

3、所述方法包括如下步骤：将待测序的肽段进行如下两种标记得到c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段，完成用于蛋白质从头测序的肽段两末端标记；

4、所述c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段是将待测序的肽段的c端进行18o标记和n端进行c13乙酰化标记得到的标记物为c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段，

5、为了解决上述问题，本发明还提供了用于蛋白质从头测序的肽段的制备方法。

6、所述方法包括如下步骤：将上述的c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段等量混合。

7、如上所述的方法，所述待测序的肽段的分子量不大于6000da。

8、上文中，所述待测序的肽段可为解离后的肽段。所述解离后的肽段可为经酶解或酸性水解后的肽段。上述经酶解或酸性水解为测序前对大分量多肽的处理方法。除上述酶解或酸性水解方法外，还包括其他能对多肽进行解离获得用于质谱测序的肽段的方法。

9、上文中，c端18o标记可为多肽c端羧基两个氧原子均为18o。

10、上文中，c端18o标记可通过将多肽溶于含有胰蛋白酶的h218o中37℃置换24h生成。

11、上文中，n端c13乙酰化标记可通过将多肽与13c标记的乙酸nhs酯反应。

12、上文中，n端乙酰化标记可通过将多肽与乙酸nhs酯反应。

13、上文中，所述肽段可为酶解后的多肽。所述酶解可为胰蛋白酶酶解或赖氨酸蛋白酶酶解。

14、如上任一所述的方法，所述肽段为具有一种或一种以上序列的肽段。

15、为了解决上述问题，本发明还提供了肽段

16、所述肽段由如上任一所述的方法制备。

17、为了解决上述问题，本发明还提供了一种多肽质谱测序的分析方法。

18、所述方法包括：用于接收混合肽段的二级碎裂谱图，所述混合肽段是如上所述c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段组成，从二级碎裂谱图中找到质量差符合2.0067和2.0017da且成对峰强度比例在0.25-4之间的离子对，使用质量小b离子和质量大的y离子生成新谱图。

19、如上任一所述的方法在下述任一中的应用：

20、a1)蛋白质重头测序或制备蛋白质重头测序产品中的应用；

21、a2)检测或辅助检测肽段翻译后修饰或制备检测或辅助检测肽段翻译后修饰产品中的应用。

22、如上所述的肽段在下述任一中的应用：

23、a1)蛋白质重头测序或制备蛋白质重头测序产品中的应用；

24、a2)检测或辅助检测肽段翻译后修饰或制备检测或辅助检测肽段翻译后修饰产品中的应用。

25、如上所述的方法在下述任一中的应用：

26、a1)蛋白质重头测序或制备蛋白质重头测序产品中的应用；

27、a2)检测或辅助检测肽段翻译后修饰或制备检测或辅助检测肽段翻译后修饰产品中的应用。

28、有益效果：

29、针对蛋白质(组)质谱数据从头测序难度大和准确度低的问题，本发明通过结合肽段n端的乙酰化反应和c端18o标记，使经过两种修饰的肽段在质谱中共碎裂，产生b/y离子对，易于与谱图中其余噪音及干扰离子区分，便于谱图的从头测序。

30、将待测序的肽段进行如下两种标记得到c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段，完成用于蛋白质从头测序的肽段两末端标记；

31、所述c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段是将待测序的肽段的c端进行18o标记和n端进行c13乙酰化标记得到的标记物为c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段。

32、用于接收混合肽段的二级碎裂谱图，所述混合肽段是由权利要求1中所述c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段组成，从二级碎裂谱图中找到质量差符合2.0067和2.0017da且成对峰强度比例在0.25-4之间的离子对，使用质量小b离子和质量大的y离子生成新谱图。

33、实验证明，本发明的肽段两末端等重同位素标记方法，可产生大量含有b/y离子对的谱图，可简化并易于从头测序。

34、本发明具有如下有益效果：

35、1、通过高效率的肽段n端乙酰化和c端18o标记反应，能使肽段混合物中约99％的肽段被成功标记，并且经鉴定能产生大量含有b/y离子对的谱图。

36、2、含有b/y离子对的谱图，通过筛选保留质量差符合理论值的离子，可将谱图简化为仅由肽段产生的碎片离子谱图，有助于谱图的从头测序。

技术特征：

1.用于蛋白质从头测序的肽段两末端标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测序的肽段进行如下两种标记得到c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段，完成用于蛋白质从头测序的肽段两末端标记；

2.用于蛋白质从头测序的肽段的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段等量混合。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测序的肽段的分子量不大于6000da。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述肽段为具有一种或一种以上序列的肽段。

5.肽段，其特征在于，所述肽段由权利要求1-4任一所述的方法制备。

6.一种多肽质谱测序的分析方法，其特征在于，所述方法包括：接收混合肽段的二级碎裂谱图，所述混合肽段是由权利要求1中所述c端18o标记且n端c13乙酰化标记的肽段和n端乙酰化肽段组成，从二级碎裂谱图中找到质量差符合2.0067和2.0017da且成对峰强度比例在0.25-4之间的离子对，使用质量小b离子和质量大的y离子生成新谱图。

7.权利要求1-4任一所述的方法在下述任一中的应用：

8.权利要求5所述的肽段在下述任一中的应用：

9.权利要求6所述的方法在下述任一中的应用：

技术总结
本发明公开了一种可用于蛋白质从头测序的肽段两末端等重同位素标记方法，可用于肽段、蛋白质的从头测序。在方法中，将待测序肽段分为两部分，一部分首先进行肽段C端的<supgt;18</supgt;O置换，随后这部分肽段使用轻标的N端乙酰化标记，另一部分肽段同时进行N端重标乙酰化标记。两部分肽段除盐测浓度后，等量混合进行质谱上样，即可获得含有质量差为2.0067Da的b离子对和2.0017Da的y离子对，在高分辨率质量分析仪中，两种离子对可被明显区分。进一步使用算法保留b/y离子对中的某一对，去除谱图中的噪音及干扰峰，简化后的谱图可用于进一步从头测序。

技术研发人员：秦伟捷,陈永乐
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24