一种基于HLA分型的肿瘤抗原筛选方法

本发明涉及一种基于hla分型的肿瘤抗原筛选方法，属于生物。

背景技术：

1、肿瘤新生抗原是肿瘤所特有的，人体正常组织不存在的抗原，可作为肿瘤治疗的潜在靶点。既往针对抗原筛选的方法大多未考虑hla分型，简单粗糙，且缺乏真实模拟体内肿瘤免疫过程的严谨验证。此外，目前肿瘤抗原大多指的是突变(mutation)来源抗原，对于突变负荷较低的肿瘤，其临床应用前景往往有限。随着高通量测序技术的不断发展，测序深度逐渐增加，对肿瘤新抗原的认识日趋完善，肿瘤抗原来源也扩展到基因融合、可变剪接和蛋白修饰等，极大的丰富了肿瘤新生抗原的获得途径，为临床亟需的特异、广谱的肿瘤新抗原筛选提供了可能。

2、既往研究进行肿瘤抗原筛选大部分使用树突细胞(dendritic cells，dcs)进行抗原筛选和免疫验证试验。但树突细胞由于数量少(外周血pbmc中不足3％)、存活周期短(最长存活周期为2周)，并且无法永生化等缺点限制了其在肿瘤抗原筛选的应用。

3、传统的快速抗原检测方法，大部分未考虑检测使用免疫细胞(供体)的hla(humanleucocyte antigen，即人类白细胞抗原)分型，其免疫验证没有针对性，获得的结果大多数为假阳性。

4、此外，既往对单一抗原采用肽脉冲的方式筛选，难以实现对目前大量新抗原进行高通量筛选的需求，因此研究者在此基础上，探索采用电转混合抗原mrna序列方式的可行性。但是dc细胞状态敏感，转染耐受性极差，电转后大部分细胞在短时间内死亡，无法高效的进行抗原提呈，严重阻碍了目前细胞治疗的研发进程。

5、并且既往抗原提呈细胞(apc)和t细胞共培养耗时长，为其2周的抗原特异性t细胞获得周期，严重堵塞了后续细胞治疗药物制备进程，不能满足晚期肿瘤病人的治疗需求。现有实验室或者公司，在制备肿瘤疫苗或者car-t或tcr-t需要尽快完成筛选后进行制备，现有实验方法严重滞缓工业或科研流程。

6、特定hla分型选择性提呈与hla匹配的高亲和力抗原肽，抗原肽-hla复合物(peptide-hla complex)暴露在细胞膜表面，使肿瘤疫苗或tcr-t细胞治疗发挥功效。根据目前数据，中国肿瘤患者高频hla以hla-a分型为主，高频排序依次为hla-a*11:01(20.893％)、hla-a*24:02(15.545％)、hla-a*02:01(12.036％)、hla-a*02:07(8.418％)、hla-a*33:03(8.229％)，其余以hla-b和hla-c亚型为辅(如图1所示)，鉴于hla分型类型多样、分布广泛，现有体外抗原筛选方法难以全面准确长效稳定的抗原验证体系进行肿瘤新生抗原免疫原性验证。

7、b细胞作为apc，有着传统抗原提呈细胞无法比拟的优势：①在抗原浓度非常低的情况下，b细胞是最有效的抗原提呈细胞；②b细胞可扩增：在适宜培养体系下，加入刺激物，b细胞的数量可在短时间内大量扩增，发挥功效；③b细胞可实现永生化，保证单次结果的重复验证；④b细胞有抗原呈递标记物，可通过流式检测快速实现；⑤在再次免疫应答中，b细胞是最重要的抗原提呈细胞。

8、因此，如果开发一种基于b细胞抗原提呈功能的肿瘤新生抗原筛选策略，能够更加快速、准确的进行肿瘤新生抗原的筛选，筛选后靶点可作为肿瘤疫苗、car-t或tcr-t细胞疗法等应用的肿瘤治疗靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的是：针对现有技术的不足，本发明提供一种基于hla分型的肿瘤抗原筛选方法，本发明方法通过b细胞表面标志物进行预检，加速筛选进程，极大弥补了既往抗原筛选的不足。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于hla分型的肿瘤抗原筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、步骤1：获取不同hla分型健康人外周血，储备b淋巴细胞和t淋巴细胞并冻存，选取不同hla分型的b淋巴细胞进行永生化，根据不同hla分型进行细胞保种和冻存；

4、步骤2.获取肿瘤候选抗原并检测其免疫提呈潜力：获取患者外科手术切除或者穿刺获得肿瘤样本进行高通量测序数据，根据算法进行潜在抗原预测，获得肿瘤候选抗原，候选抗原合成多肽后进行肽负载，或使用电转抗原mrna序列的方式进行导入b细胞，随后使用anti-human cd86+荧光抗体检测b淋巴细胞比例；与对照组相比，cd86+b细胞比例显著升高，即候选抗原具有免疫原性，能够被apc提呈；

5、步骤3.检测肿瘤候选抗原免疫激活能力：采用加载抗原的apc细胞和t细胞共培养方式进行免疫原性验证；随后采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，elisa)或elispot检测t细胞的ifn-γ分泌。

6、优选地，所述步骤1具体包括：分离不同hla分型健康人外周血单个核细胞(pbmc)，使用cd19+磁珠进行分选，分选后使用cd40l培养体系进行细胞培养；使用永生化重组载体或感染ebv病毒的方式制备永生化b细胞；检测hla分型后，进行冻存。

7、优选地，所述永生化重组载体具有如seq id no：1所示的永生化序列。

8、优选地，所述步骤2中的高通量测序为全基因组测序、全外显子测序或者转录组测序。

9、优选地，所述apc细胞和t细胞按照4:1共培养。

10、本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

11、(1)传统抗原筛选大部分是通过算法进行评分排名后得出结果，缺乏对正常人体生理免疫过程的筛选；本发明涉及方法是在生信筛选的基础上，通过人体抗原提呈细胞(apc)细胞进行抗原呈递和t细胞刺激的免疫筛选，更符合正常肿瘤免疫过程；

12、(2)目前大多数抗原体外筛选采用dcs进行抗原提呈，但是对于dc细胞无法增殖，存活时长仅为2周；无法稳定传代和无法基因编辑，导致“单次”结果不稳定，无法重复验证等问题，本发明采用永生化后的b细胞作为抗原提呈细胞，长效稳定，有力突破了当下细胞治疗研发进程中的关键瓶颈；

13、(3)本发明参考高频hla分型排布特征，分别设定不同hla分型的apc细胞进行抗原筛选，覆盖面广，特异性高；

14、(4)抗原加载方式多样化：b细胞既具有吞噬能力，可进行肽加载；也可将构建的抗原mrna序列，通过电转方式进入抗原呈递性b细胞内，进行抗原提呈；

15、(5)检测迅速：无论是采用肽负载还是电转抗原序列，均可在抗原加载后迅速使用anti-human cd86+检测b淋巴细胞比例，cd86+比例上升即为抗原加载成功，也证明这些抗原具有免疫原性；上述cd86+b细胞即为抗原提呈b淋巴细胞(antigen-presenting b cells，bapc)；全部过程不超过48小时；既往筛选肿瘤新抗原往往采用hla四聚体置换实验结合dc-t细胞共培养实验，效果不稳定同时所需时间超过2周；

16、(6)反应直接客观：验证免疫原性最直接的方式是观测t细胞效应功能；和t细胞共培养可检测ifn-γ分泌(采用elisa或elispot)，或检测cd8+t细胞中41-bb+或cd137+细胞比例，41-bb+或cd137+细胞比例上升或平均荧光强度值增加，表示加入抗原具有免疫原性，可激活机体正常免疫。