生物样本中地夸磷索和/或其代谢物的检测方法及地夸磷索钠滴眼液药代动力学的测试方法与流程

本发明涉及药物检测，具体涉及一种生物样本中地夸磷索和/或其代谢物的检测方法及地夸磷索钠滴眼液药代动力学的测试方法。

背景技术：

1、随着电子产品的普及，用眼疲劳已经成为现代人日常疾病之一，市场治疗干眼症药品的需求也越来越大。荷尔蒙失衡、神经激素障碍、泪腺细胞凋亡等会引发干眼症。药物副作用、环境因素或不健康用眼习惯也会导致干眼症。

2、地夸磷索钠为第二代尿苷核苷酸近似物p2y2受体激动剂，其作用于结膜上皮及杯状细胞膜上的p2y2受体，通过激活细胞钙依赖氯离子通道，促进泪液分泌，增加分泌型黏蛋白的分泌及上调跨膜黏蛋白，从而增加泪膜稳定性。地夸磷索钠滴眼液于2010年10月在日本获批上市，适用于经诊断为伴随泪液异常的眼角膜上皮损伤的干眼患者。地夸磷索钠滴眼液治疗机制新颖，未发现严重严重的眼部和全身性不良反应，且用药耐受性良好，可长期用于治疗干眼症症状。地夸磷索钠滴眼液为高壁垒干眼症品种，虽然已有多家药企递交仿制或改良型新药申请，但目前国内获批的地夸磷索钠滴眼液仅有原研进口产品，商品名为丽爱思，与该品种的药代动力学开展难度大有关。

3、地夸磷索钠在体内的稳定性较差，在人血浆和人肝微粒体的体外代谢反应中，地夸磷索钠迅速代谢，生成尿苷、尿嘧啶核苷酸(ump)、二磷酸核苷酸(udp)和三磷酸尿苷(utp)。原研药(地夸磷索钠滴眼液)采用14c放射性同位素标记的方式进行药代动力学研究，动物眼部组织内的分布结果显示，对家兔单次滴眼给予14c-地夸磷索钠滴眼液，在结膜、角膜等外部组织检测到高浓度放射性，滴眼5min，结膜和角膜显示最高放射性浓度，滴眼24h后变为最高放射性浓度的4～30％。然而，上述放射性同位素示踪法无法区分原型药和4种代谢物类型。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物样本中地夸磷索和/或其代谢物的检测方法及地夸磷索钠滴眼液药代动力学的测试方法。本发明提供的检测方法能够区别并检测到生物样本中的地夸磷索以及尿苷、ump、udp和utp四种代谢物，对不同给药时间的待测生物样本的定量检测结果进行统计分析即可得到药代动力学曲线。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种生物样本中地夸磷索和/或其代谢物的检测方法，包括以下步骤：

4、将待测生物样本、内标工作液和甲酸-乙腈溶液混合后离心，所得上清液为待测样品液；所述待测生物样本为地夸磷索钠滴眼液给药后的眼部样品或血浆样品；

5、将所述待测样品液进行高效液相-串联质谱检测，得到地夸磷索和/或其代谢物的检测结果；所述代谢物包括尿苷、ump、udp和utp中的一种或几种；

6、所述高效液相-串联质谱检测包括高效液相色谱分离和质谱检测，所述高效液相色谱分离包括对地夸磷索的高效液相色谱分离和/或对代谢物的高效液相色谱分离；

7、所述对地夸磷索的高效液相色谱分离的条件包括：流动相a为0.5～2mm乙酸二丁基铵水溶液，流动相b为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序包括：0～0.5min，所述流动相b体积分数为5～15％；0.5～1min，所述流动相b的体积分数由5～15％增加到35～50％；1～1.5min，所述流动相b的体积分数由35～50％增加到85～90％；1.5～3.5min，所述流动相b的体积分数为85～90％；3.5～4min，所述流动相b的体积分数由85～90％降低到5～15％；4～6min，所述流动相b体积分数为5～15％；

8、所述对代谢物的高效液相色谱分离的条件包括：流动相a为2～10mm乙酸铵-0.1～0.5v/v％乙酸水溶液，流动相b为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序包括：0～1min，流动相b的体积分数为90～98％；1～1.5min，流动相b的体积分数由90～98％降低到40～60％；1.5～2min，流动相b的体积分数由40～60％降低到10～30％；2～2.5min：流动相b的体积分数由10～30％降低到1～5％；2.5～3min，流动相b的体积分数为1～5％；3～3.5min，流动相b的体积分数由1～5％增加到90～98％；3.5～7min，流动相b的体积分数为90～98％。

9、优选的，所述对地夸磷索的高效液相色谱分离的条件包括：色谱柱为uplc色谱柱，柱温为30～40℃，流动相流速为0.3～0.5ml/min，进样量为1～10μl。

10、优选的，所述对代谢物的高效液相色谱检测条件包括：色谱柱为uplc色谱柱，柱温为30～40℃，流动相流速为0.1～0.3ml/min，进样量为1～10μl。

11、优选的，所述质谱检测的条件包括：采用电喷雾离子源，负离子模式，多重反应监测，毛细管电压为3kv，锥孔电压为60v，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂流速为900l/h，锥孔气流速为150l/h；地夸磷索的检测离子对为789.06→158.92，锥孔电压为60v，碰撞能量为54v；尿苷的检测离子对为243.04→109.98，锥孔电压为42v，碰撞能量为16v；ump的检测离子对为322.93→96.95，锥孔电压为41v，碰撞能量为24v；udp的检测离子对为402.97→158.86，锥孔电压为43v，碰撞能量为26v；utp的检测离子对为482.94→158.99，锥孔电压为27v，碰撞能量为28v；内标物的检测离子对为421.13→127.05，锥孔电压为49v，碰撞能量为26v。

12、优选的，所述眼部样品包括泪液、房水或眼部组织样品；所述眼部组织样品包括角膜、结膜、玻璃体、晶状体、视网膜、脉络膜或巩膜。

13、优选的，所述眼部组织样品在使用前先进行预处理，所述预处理包括：将眼部组织样品与甲醇水溶液混合，进行匀浆后离心，取上清液使用。

14、优选的，所述内标工作液中的内标物包括氯沙坦，溶剂包括甲醇水溶液；所述内标工作液的浓度为0.5～2μg/ml；

15、所述待测生物样本与内标工作液的体积比为5:1。

16、优选的，所述甲酸-乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.5％；

17、所述待测生物样本与甲酸-乙腈溶液的体积比为1：2～3。

18、本发明提供了一种地夸磷索钠滴眼液药代动力学的测试方法，包括以下步骤：

19、按照上述技术方案所述的检测方法得到地夸磷索钠滴眼液给药后不同时间的待测生物样本中地夸磷索或其代谢物的浓度检测结果；

20、采用统计软件分别对地夸磷索和代谢物的浓度检测结果进行统计分析，分别得到地夸磷索的药时曲线和代谢物的药时曲线。

21、优选的，所述统计软件包括winnonlin8.1统计软件。

22、本发明提供了一种生物样本中地夸磷索和/或其代谢物的检测方法，包括以下步骤：将待测生物样本、内标工作液和甲酸-乙腈溶液混合后离心，所得上清液为待测样品液；所述待测生物样本为地夸磷索钠滴眼液给药后的眼部组织液体样品或血浆样品；将所述待测样品液进行高效液相-串联质谱检测，得到地夸磷索和/或其代谢物的检测结果；所述代谢物包括尿苷、ump、udp和utp中的一种或几种。本发明将待测样品液进行高效液相-串联质谱检测，能够实现生物样本中尿苷、ump、udp和utp四种代谢物以及地夸磷索的快速定性定量分析，克服了14c放射性同位素标记方法无法区分原型药和代谢物类型以及14c放射性同位素价格昂贵的缺点。而且，本发明提供的检测方法具有简便、快捷、灵敏度高的优点。

23、本发明采用统计软件分别对地夸磷索钠滴眼液不同给药时间后的待测生物样本中地夸磷索和代谢物的浓度检测结果进行统计分析，即可分别得到地夸磷索的药时曲线和代谢物的药代动力学参数和药时曲线图。本发明通过生物样本中地夸磷索、尿苷、ump、udp和utp的浓度表征地夸磷索钠滴眼液在生物样本中的分布特征，为地夸磷索钠滴眼液在生物样本中的研究提供了有效技术手段。本发明提供的测试方法克服了14c放射性同位素标记方法无法区分原型药和代谢物类型和价格昂贵的缺点，也克服了由于地夸磷索钠滴眼液因原型药物(地夸磷索钠)快速代谢，无法通过检测原型药物获得眼部药代动力学特征的缺点。

24、如实施例测试结果所示，采用本发明提供的检测方法，血浆和房水中的地夸磷索检测浓度均低于定量下限(2ng/ml)；角膜和结膜中均仅10min时间点可检测到定量浓度，其他时间点均低于定量下限；泪液中仅10min、0.5h和1h时间点测到定量浓度，说明地夸磷索对新西兰兔滴眼给药迅速代谢。血浆中尿苷中尿苷、ump、udp和utp扣除空白内源性浓度，给药后血浆中的尿苷、ump、udp和utp未见明显变化；房水中尿苷、ump、udp和utp扣除空白内源性浓度，给药后房水中ump、udp浓度未见明显变化，尿苷和utp有明显的分布和排泄；角膜、结膜和泪液中尿苷、ump、udp、utp扣除空白内源性浓度，给药后角膜、结膜和泪液中尿苷、ump、udp、utp均有明显的分布和排泄。