一种人尿AD7c-NTP的胶体金免疫层析快检试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断，尤其涉及一种人尿ad7c-ntp的胶体金免疫层析快检试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（ad）是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。阿尔茨海默病的发病人群主要包括老年人、有家族史者、高血压患者、长期接触铝制品者、长期大量饮酒者等，其多发群体为60岁以上的人群。

2、目前，阿尔茨海默病的早期筛查方式主要包括实验室检查、影像学检查、脑电图检查、神经心理学检查以及基因检查等。其中，实验室检查：阿尔茨海默氏病相关神经丝蛋白（alzheimer-associated neuronal thread protein，ad7c-ntp）是一种41kda大小的在神经元中表达的跨膜磷蛋白。在1997年第一次被学者在阿尔茨海默患者的颞叶脑组织中分离得到。之后的研究发现ad7c-ntp会由神经元直接分泌至脑脊液中，同时也发现ad7c-ntp的含量在阿尔茨海默病患者，轻度认知障碍人群，正常人群中依次递减，因此医学上会使用脑脊液中的ad7c-ntp含量来作为一种生物标记物来检测患者是否存在阿尔茨海默病，但是脑脊液抽取对患者损伤过大。影像学检查：一般需进行ct检查，患者常会显示存在脑室扩大、脑萎缩的情况，还会在头颅mri检查中发现双侧颞叶、海马萎缩，如果使用pet成像技术，还可见脑内淀粉蛋白沉积，但是ct检查对人的损伤较大。神经心理学检查：患者需要通过该检查进行认知评估，主要有注意力、言语功能、记忆功能、知觉等，判断认知能力及精神状态是否存在异常。基因检查：如果患者存在明确的家族史，则还需进行基因检测，如psen1、psen2、app等，从而更有利于预防。神经心理学检查和基因检查的方法为主观判断方法，准确性差。

3、研究发现ad7c-ntp是一种等电位在9左右的碱性蛋白，并且会进一步参与体内循环并最终被肾小管富集随尿液排出，研究表明尿液中的ad7c-ntp同样可以反应是否存在阿尔茨海默病，因此现在多使用尿液作为一个无创的生物标记物检测对象。目前的实验室检测方法多以酶联免疫吸附试验（elisa）为主，通过微孔板进行微量的抗原抗体特异性结合来检测ad7c-ntp蛋白，但是elisa检测需要酶标仪、微孔板、孵育箱等专业设备，并且耗时长不适用于快速简便检测。因此，现有技术中采用人ad7c-ntp胶体金检测试纸条，能够实现人ad7c-ntp蛋白的快速简便检测。但是该技术仍存在下述问题：经研究发现，随着年龄的增长，由于新陈代谢的降低，60岁以上的人群的尿液中的ad7c-ntp蛋白浓度相比于年轻人高，因此，该技术检测下限较高、特异性不高，且灵敏性较差。鉴于此，提供一种人尿ad7c-ntp的胶体金免疫层析快检试剂盒及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，适应现实需要，提供一种人尿ad7c-ntp的胶体金免疫层析快检试剂盒，采用ad7c-ntp的两种不同单克隆抗体以及对应的兔抗小鼠hrp偶联igg形成双抗夹心，可以实现对60岁以上的但未确诊为阿尔茨海默病的人的浓缩尿液中的ad7c-ntp的快速检测，具有较高的特异性和敏感性。

2、为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种人尿ad7c-ntp的胶体金免疫层析快检试剂盒，所述试剂盒主要由检测卡构成，所述检测卡包括pvc底板，以及顺次搭接粘在所述pvc底板上的样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述玻璃纤维素膜上吸附有纳米金标记的单克隆检测抗体：mouseanti-ad7c-ntp antibody（v3006）；所述硝酸纤维素膜上由样品垫端到吸水垫端依次设有检测线（t线）和质控线（c线）；所述检测线包被有ad7c-ntp单克隆捕获抗体：mouse anti-ad7c-ntp antibody（v3007）；所述质控线包被有兔抗小鼠偶联hrp igg；这两种抗体可以形成互不影响其与抗原结合的双抗夹心结构；所述检测卡用于检测人浓缩尿液检测中的ad7c-ntp蛋白，所述人浓缩尿液为经超滤浓缩20倍的人尿液样本，所述检测卡的的检出下限为7-17 ng/ml。

4、本发明采用ad7c-ntp的两种不同单克隆抗体以及对应的兔抗小鼠hrp偶联igg形成双抗夹心，并通过人尿液样本经超滤浓缩20倍，可以实现对60岁以上的但未确诊为阿尔茨海默病的浓缩尿液中的ad7c-ntp的快速检测，且检出下限达到7-17 ng/ml，具有较高的特异性和敏感性，作为早期筛查检测有操作简单，结果准确快速的优点。

5、优选地，所述检测线包被的ad7c-ntp单克隆捕获抗体的浓度为500 ng/ml，抗体使用0.01 mol/l且ph为7.0的pbs稀释。

6、优选地，所述质控线包被的兔抗小鼠偶联hrp igg的浓度为800 ng/ml，抗体使用0.01 mol/l且ph为7.0的pbs稀释。

7、优选地，所述人尿液样本取样于60岁以上的未确诊为阿尔茨海默病的人。

8、优选地，所述人浓缩尿液的制备方法为：将人尿液样本经截留口径为10 kda的超滤管超滤浓缩20倍。

9、本发明还公开了上述人尿ad7c-ntp的胶体金免疫层析快检试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、取1 ml 0.25 mmol/l的纳米金溶液，逐滴加入0.1 mol/l碳酸钾溶液至纳米金溶液ph值为9.0；之后静置2 min，再加入20 μg ad7c-ntp单克隆检测抗体进行检测抗体的胶体金标记，吹打混匀后室温静置50 min，然后向其中加入5 % bsa溶液使得bsa的工作浓度为1 %，轻柔吹打混匀后室温静置2 h，即得到标记好的胶体金-抗体复合物溶液；

11、s2、对步骤s1中得到的标记好的胶体金-抗体复合物溶液进行除杂去除多余的纳米金，在4 ℃下13000 rpm离心45 min，去除上清，黑色沉淀即为胶体金-抗体复合物；

12、s3、使用复溶液对步骤s2中的胶体金-抗体复合物进行复溶，即可得到酒红色胶体金-抗体复合物溶液；

13、s4、将玻璃纤维素膜裁剪成0.5 cm×1 cm的尺寸后放入15 μl步骤s3得到的复合物溶液中，浸泡5 min后取出37 ℃烘干3 h，烘干后四周各减去0.1 cm，得到带有胶体金-检测抗体标记的玻璃纤维素膜；

14、s5、取pvc底板以及硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫，硝酸纤维素膜裁剪成2.5 cm×0.5 cm，吸水垫裁剪成2 cm×0.5 cm，样品垫裁剪成1.5 cm×0.5 cm，从上到下依次将裁剪好的样品垫、标记好的玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在pvc底板上，对硝酸纤维素膜的上1/3处和下1/3处分别进行检测线（t线）、质控线（c线）抗体的包被，完全干燥后即可制得人尿液中的ad7c-ntp的快速胶体金免疫层析检测卡。

15、进一步地，所述复溶液包括0.01 mol/l ph为7.0的pbs缓冲液、1 % bsa、5 %蔗糖、0.5 % peg20000和0.5 % tween-20。

16、进一步地，所述检测卡的每个组分之间均存在0.5-1.0 cm的交互层叠。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明采用ad7c-ntp的两种不同单克隆抗体以及对应的兔抗小鼠hrp偶联igg形成双抗夹心，并通过人尿液样本经超滤浓缩20倍，可以实现对60岁以上的但未确诊为阿尔茨海默病的浓缩尿液中的ad7c-ntp的快速检测，且检出下限达到7-17 ng/ml，具有较高的特异性和敏感性，作为早期筛查检测有操作简单，结果准确快速的优点。

19、2、本发明利用两种匹配的单克隆抗体形成稳定的双抗夹心来进行高效的标定，同时使用纳米金标记ad7c-ntp的单克隆检测抗体，优化了elisa实验方法中需要多次加样洗板孵育等复杂耗时的步骤，使得整个检测过程在30 min中可以完成，同时这种胶体金标记的检测抗体在玻璃纤维素膜上可以稳定存在，因此整个试剂盒可在室温下干燥保存很长时间，非常适合用于快速简便筛查与风险评估。