一种基于便携式血糖仪的核酸适配体传感器对孕酮的即时检测方法

本发明属于，具体涉及一种基于便携式血糖仪的核酸适配体传感器对孕酮的即时检测方法。

背景技术：

1、孕酮（progesterone，p4）是由卵巢黄体分泌的类固醇激素，是早期判断受精后奶牛妊娠与否的重要标志物。孕酮的即时、灵敏检测是实现奶牛早孕诊断的重要手段。简单、准确的早孕现场诊断可以进一步减少检测时间、降低对专业技术人员的依赖。因此，建立孕酮的便携、即时检测方法具有重要意义。基于抗原-抗体的免疫测定方法能够实现孕酮的即时检测，但抗体花费高、制备困难及使用条件苛刻等局限影响其在早孕诊断中的应用。核酸适配体作为 “化学抗体” 和新型识别分子，除具有可媲美抗体的高亲和力和特异性，还具有成本低、易合成、性质稳定等独特优势。

2、现有技术1：金纳米颗粒（aunps）的聚集和分散受到p4结合适配体和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（ctab）的影响。当靶标p4存在时，适配体与p4结合形成复合物，溶液中的ctab诱导aunps聚集，导致aunps溶液由红色变为蓝色。当p4不存在时，ctab与适配体结合，aunps仍呈分散状态，即为红色。因此，可以肉眼通过颜色变化检测p4。通过对吸光度和颜色变化的监测，建立了检测p4的ctab诱导比色法。但通过肉眼观察仅能够实现p4的定性检测，定量检测仍需依靠酶标仪等光谱仪器。

3、现有技术2：光电化学生物传感器：利用具有良好阴极光电流响应的碳点与氧化石墨烯(cds-go)复合材料作为光活性材料，并将p4抗体(ab)固定在其上。同时，将高亲和力的p4适配体固定在au-cuo-cu2o上作为生物偶联物。当p4存在时，适配体-au-cuo-cu2o生物偶联物可以通过ab-p4-适配体相互作用放大cds-go修饰电极的阴极光电流进而实现对p4的灵敏检测。

4、现有技术3：通过将氨基功能化的p4特异性适配体共价固定在电极表面，成功研制了一种无标记的电化学孕酮适配体传感器。采用静电纺丝技术合成了镍金杂化纳米纤维。将电纺丝nio-aunfs分散在合成的石墨烯量子点(gqds)溶液，制备出gqds-nio-aunfs纳米复合材料。利用新型gqds - nio-aunfs纳米结构结合功能化多壁碳纳米管(f-mwcnts)对丝网印刷碳电极(spce)进行修饰，构建具有大量羧基官能团的有效固定化基质，并将氨基功能化的p4特异性适配体共价固定在电极表面。适配体-p4复合物的形成导致传感界面上的电子转移反应受阻，从而降低了氧化还原探针的峰值电流。在此基础上，通过监测[fe(cn)6]3 -/4 -峰电流的差分脉冲伏安(dpv)响应随孕酮浓度的增加而降低，可以实现孕酮定量检测。

5、上述传感体系虽然具有较好的灵敏度和线性范围，但需要电化学/光学等检测仪器的使用，需要专业技术人员，使其在现场实时检测的应用中受到局限。基于孕酮适配体和金纳米颗粒的比色传感器能通过颜色变化实现对孕酮的定性检测，但仅依靠目视检测无法实现精确定量。即现有文献报道孕酮的现场即时检测方法多为定性比色方法，无法实现准确的含量分析。现有即时检测设备仍存在实用性差、操作步骤复杂等问题，如何利用便携、易操作和低成本的即时检测设备实现孕酮含量的快速检测，是亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于便携式血糖仪的核酸适配体传感器对孕酮的即时检测方法，用于解决现有即时检测设备仍存在实用性差、操作步骤复杂等问题。

2、为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

3、一种基于便携式血糖仪的核酸适配体传感器对孕酮的即时检测方法，其是以孕酮的核酸适配体作为特异性识别元件，通过链置换与磁分离，实现非糖靶标孕酮信号转化为血糖仪可测的葡萄糖信号；所述孕酮的核酸适配体用于结合孕酮（p4）；具体地其包括如下步骤：

4、s1、制备基于便携式血糖仪的核酸适配体传感器；

5、s2、将核酸适配体传感器与待测溶液混合，反应后，经磁分离后取上清液，将上清液与直链淀粉溶液混合孵育后，进行血糖仪检测，获得待测溶液的血糖读数；

6、s3、将孕酮标准溶液分别与核酸适配体传感器混合进行步骤s2操作，同时空白溶液做上述实验获得空白值；以孕酮浓度为横坐标，孕酮标准溶液的血糖仪读数与空白值以之后获得的差值为纵坐标进行线性拟合，得到其线性方程即标准曲线；

7、s4、将步骤s2获得的待测溶液的血糖读数代入标准曲线中即可获得待测溶液中孕酮的浓度。

8、如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，所述核酸适配体传感器为制备方法为将适配体互补链（cs）与葡萄糖淀粉酶（ga）的偶联物cs-ga与生物素修饰的核酸适配体（apt）进行第一次混合孵育后，加入链霉亲和素磁珠进行第一次震荡偶联后，用缓冲液洗涤后获得核酸适配体传感器。

9、进一步，优选地，所述适配体互补链为序列如seq id no.1所示，适配体互补链的5′端有—-sh-sh-修饰；所述核酸适配体的序列如seq id no.2所示，核酸适配体的5′端有biotin修饰；链霉亲和素磁珠的粒径为1 μm，缓冲液的配方为含终浓度为10 mm 的tris-hcl、10 mm 的nacl、5mm mg的cl2和0.01%的吐温-20，ph值为7.3。

10、如上所述的方法，优选地，所述偶联物cs-ga的制备方法为将适配体互补链与磷酸钠缓冲液和三(2-羧乙基)膦混合孵育后，移至amicon-3 k超滤管内，离心，之后用缓冲液a纯化，获得活化的cs；

11、将葡萄糖淀粉酶溶液与磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯溶液混匀后孵育，移至amicon-30 k超滤管内，离心，之后用缓冲液a纯化，获得活化的葡萄糖淀粉酶；

12、将活化的cs与活化的葡萄糖淀粉酶混合，在室温下孵育，移至amicon-100 k超滤管内，纯化后获得偶联物cs-ga，溶于缓冲液b中。

13、其中，缓冲液a的配方为：含终浓度为0.1 m的磷酸钠和100 mm的nacl，ph值为7.3，缓冲液b的配方为：含终浓度为10 mm的tris-hcl、10 mm的 nacl和5 mm的 mgcl2，ph值为7.3。

14、如上所述的方法，优选地，所述偶联物cs-ga与生物素修饰的核酸适配体混合得到混合物；将上述混合物与的链霉亲和素磁珠震荡偶联；第一次混合孵育条件为，95 ℃孵育10 min后缓慢冷却至室温，第一次震荡偶联的时间为0.5~1.5h。

15、进一步的，所述偶联物cs-ga的浓度为6 μm用量为 30 μl；生物素修饰的核酸适配体的浓度为5μm用量为30 μl，链霉亲和素磁珠的的浓度为10 mg/ml用量为30 μl。

16、如上所述的方法，优选地，在步骤s2和s3中，待测溶液和孕酮标准溶液中的溶剂为缓冲液c，缓冲液c的配方为：含终浓度为10 mm 的tris-hcl、10 mm的nacl、5 mm的 mgcl2和0.01%的吐温-20，ph 值为7.3。

17、如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，反应时间为优选为20~120 min，最优选为60 min；反应在震荡条件下，振荡按500~800 rpm速率进行；混合孵育的时间为20~40 min，最优选混合孵育的时间为30 min。

18、如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，核酸适配体传感器的用量为30 μl，与待测溶液的体积比为1：1。直链淀粉溶液的浓度为2 m，上清液与直链淀粉溶液的用量比为1:1。

19、一种基于血糖仪的核酸适配体传感器用于孕酮的检测的试剂盒，其包括如上所述的核酸适配体传感器，所述核酸适配体传感器为制备方法为将序列如seq id no.1所示的适配体互补链与葡萄糖淀粉酶的偶联物cs-ga与生物素修饰的序列如seq id no.2所示的核酸适配体进行第一次混合孵育后，加入链霉亲和素磁珠进行第一次震荡偶联后，用缓冲液洗涤后获得核酸适配体传感器。

20、进一步，优选地，试剂盒还包括直链淀粉溶液、孕酮标准溶液。

21、本发明的有益效果在于：

22、本发明提供的一种基于血糖仪的核酸适配体传感器用于孕酮的定量检测，将非糖靶标浓度转化为血糖仪可测的直链淀粉浓度，实现血糖仪对非糖靶标-孕酮的即时定量检测，所用仪器仅需要不需要血糖仪，不需要其他电化学/光学等检测仪器，检测成本低，操作简单，为实现现场、准确的孕酮含量检测，为奶牛或人早期妊娠诊断奠定基础。