一种锌转运蛋白8抗体检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于体外诊断，具体涉及一种锌转运蛋白8抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、锌转运蛋白8抗体是新发现的1型糖尿病的特异性抗体。它与蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(ia-2a)、胰岛素自身抗体(iaa)、谷氨酸脱羧酶抗体(gada)及胰岛细胞抗体(ica)等自身抗体均隶属于胰岛自身抗体，是胰岛β细胞遭受自身免疫损害的标志物，是诊断自身免疫性糖尿病，包括1型糖尿病及成人隐匿性自身免疫糖尿病(lada)的关键指标，用于自身免疫性糖尿病与2型糖尿病的鉴别。

2、目前，临床上检测锌转运蛋白8抗体的常用方法有放射性免疫法、酶联免疫吸附法和磁微粒化学发光法。放射性免疫法的基本原理是先用放射性的i125标记重组znt8抗原，血清中的特异性抗体先与抗原结合形成抗原抗体复合物，加入二抗后孵育形成抗原-抗体-二抗复合物，离心后检测放射性强弱从而判断血清中特异性抗体的含量。但该法操作较为复杂、成本较高。酶联免疫吸附法同样存在操作较为复杂和试剂种类较多的问题。磁微粒化学发光法是利用双抗原夹心法原理进行检测，测定相关发光值rlu，具有操作简便、成本较低的优势。如专利cn 106226526a及cn 114184793 a均公开了一种锌转运蛋白8抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括锌转运蛋白8包被的固相载体(磁微粒)工作液、吖啶酯标记的纯化的锌转运蛋白8工作液、锌转运蛋白8抗体定标品和化学发光底物液。但其荧光标记物采用锌转运蛋白8，锌转运蛋白8抗原分子结构复杂，常以多聚体形式存在，采用化学发光标记物对锌转运蛋白8抗原进行标记，锌转运蛋白8抗原活性不高，需要利用还原剂对锌转运蛋白8多聚体抗原进行还原处理后进行标记反应，来提高其检测灵敏度，但同时也增加了处理的程序。

3、另外，在采用磁微粒化学发光技术进行锌转运蛋白8抗体检测的过程中，首先是样本中的特异性的锌转运蛋白8抗体和磁性微粒上包被的锌转运蛋白8抗原反应，形成抗原-抗体复合物。然后在磁场作用下，磁微粒吸附到反应管壁，未结合的物质被清洗液洗去。再加入抗体荧光标记物反应，形成抗体-抗原-荧光标记抗体复合物进行检测。因此，磁性微粒与抗原的结合稳定性及磁微粒磁场分离的效果对检测结果的准确性影响显著。通过磁性微粒的表面修饰可以改善与抗原、抗体的结合稳定性，但目前采用偶联反应所得功能修饰的磁性微粒性能还有待进一步改善。

技术实现思路

1、针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种锌转运蛋白8抗体检测试剂盒。本发明的检测试剂盒中采用羊抗人igg-荧光标记物替代锌转运蛋白8抗原，与发光标记物的结合率高，并通过形成锌转运蛋白8抗体-抗原-羊抗人igg荧光标记复合物进行检测，可显著提高检测灵敏度。

2、本发明的另一目的在于提供上述锌转运蛋白8抗体检测试剂盒的制备方法。

3、本发明目的通过以下技术方案实现：

4、一种锌转运蛋白8抗体检测试剂盒，包括锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液、羊抗人igg抗体荧光标记物溶液、样本稀释液、校准品溶液和化学发光底物液。

5、进一步地，所述锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液包括浓度为1～5mg/ml的锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒和ph为7～9的tris缓冲液。

6、进一步地，所述羊抗人igg抗体荧光标记物溶液包括浓度为0.1～1mg/ml的羊抗人igg抗体吖啶酯标记物和ph为7～9的tris缓冲液。

7、进一步地，所述样本稀释液为ph为7～9的tris缓冲液，内含0.2％～1％牛血清白蛋白、0.05％～0.2％表面活性剂和0.05％～0.2％防腐剂。

8、进一步地，所述校准品溶液为浓度分别为5au/ml、50au/ml和400au/ml锌转运蛋白8抗体标准溶液。

9、进一步地，所述化学发光底物液包括预激发液和激发液；所述预激发液为浓度为0.05～0.25mol/l的naoh溶液，所述激发液为浓度为0.05～0.2mol/l的h2o2溶液。

10、进一步地，所述锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液通过如下方法制备得到：

11、(1)将二氧化硅包覆四氧化三铁磁性微球加入到水和乙醇的混合溶剂中搅拌分散均匀，然后加入硅烷偶联剂3-[3-羧基烯丙酰胺基]丙基三乙氧基硅烷进行搅拌反应，产物经过滤、洗涤、干燥，得到表面功能修饰的磁性微球；

12、(2)将表面功能修饰的磁性微球与锌转运蛋白8在缓冲溶液中混合孵育，得到锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液。

13、进一步地，步骤(1)中所述水和乙醇的混合溶剂中水和乙醇的体积比为1～10:90～99；所述硅烷偶联剂3-[3-羧基烯丙酰胺基]丙基三乙氧基硅烷的加入量为二氧化硅包覆四氧化三铁磁性微球质量的2％～10％。

14、进一步地，步骤(2)中所述表面功能修饰的磁性微球与锌转运蛋白8混合孵育的质量比为100:5～10。

15、本发明采用的硅烷偶联剂3-[3-羧基烯丙酰胺基]丙基三乙氧基硅烷同时含有氨基和羧基，对锌转运蛋白8具有良好的结合力，稳定性及磁分离效果好。

16、更优选地，所述锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液通过如下方法制备得到：

17、1)将硅酸酯、封端剂1,3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷和四氧化三铁磁性纳米微球加入到水和乙醇的混合溶剂中搅拌混合均匀，惰性气氛保护下升温至60～90℃，然后滴加酸催化剂溶液进行搅拌反应，反应完成后经过滤、洗涤、干燥，得到羧基mq硅树脂包覆磁性微球；

18、2)将羧基mq硅树脂包覆磁性微球与锌转运蛋白8在缓冲溶液中混合孵育，得到锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液。

19、进一步地，步骤1)中所述硅酸酯为硅酸钠、正硅酸甲酯和正硅酸乙酯中的至少一种；所述硅酸酯、封端剂1,3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷和四氧化三铁磁性纳米微球加入的质量比为10:0.5～2:10～40。

20、进一步地，步骤1)中所述水和乙醇的混合溶剂中水和乙醇的体积比为4～7:6～3。该溶剂能溶解或部分溶解反应原料硅酸酯和封端剂，但不溶解反应产物羧基mq硅树脂，反应生成的羧基mq硅树脂在磁性纳米微球表面原位析出，一步实现对磁性纳米颗粒的良好包覆和表面功能基团修饰。产物经简单过滤即可分离，工艺简单。

21、进一步地，步骤2)中所述羧基mq硅树脂包覆磁性微球与锌转运蛋白8混合孵育的质量比为100:5～10。

22、本发明通过进一步采用羧基mq硅树脂包覆磁性微球，相比硅烷偶联剂进行偶联表面功能修饰的磁性微球，其羧基分布更为均匀，活性更高，与锌转运蛋白8的结合稳定性及磁分离效果更好，从而进一步提高检测准确性。

23、上述锌转运蛋白8抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下制备步骤：

24、a、将锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒用tris缓冲液稀释至浓度为1～5mg/ml，得到锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液；

25、b、将吖啶酯与羊抗人igg抗体在tris缓冲溶液中混合孵育，稀释至浓度为0.1～1mg/ml，得到羊抗人igg抗体荧光标记物溶液；

26、c、将0.2％～1％牛血清白蛋白、0.05％～0.2％表面活性剂和0.05％～0.2％防腐剂加入到tris缓冲液中，得到样本稀释液；

27、d、采用样本稀释液将锌转运蛋白8抗体标准品依次稀释至浓度分别为5au/ml、50au/ml和400au/ml，得到校准品溶液；

28、e、将锌转运蛋白8抗原包被的磁微粒溶液、羊抗人igg抗体荧光标记物溶液、样本稀释液、校准品溶液和化学发光底物液按规格分装，得到锌转运蛋白8抗体检测试剂盒。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

30、(1)本发明的检测试剂盒中采用羊抗人igg-荧光标记物替代锌转运蛋白8抗原，与发光标记物的结合率高，并通过形成锌转运蛋白8抗体-抗原-羊抗人igg荧光标记复合物进行检测，可显著提高检测灵敏度。无需额外对荧光标记物进行处理，检测步骤简单方便。

31、(2)本发明试剂盒所使用的磁性微球可采用特定硅烷偶联剂3-[3-羧基烯丙酰胺基]丙基三乙氧基硅烷进行表面修饰，其同时含有氨基和羧基，对锌转运蛋白8具有良好的结合力，稳定性及磁分离效果较好。

32、(3)本发明试剂盒所使用的磁性微球可进一步通过特定工艺一步实现羧基mq硅树脂对磁性纳米颗粒的良好包覆和表面功能基团修饰，其羧基分布更为均匀，活性更高，与锌转运蛋白8的结合稳定性及磁分离效果更好，从而进一步提高检测准确性。