一种重组霍乱毒素B亚单位中氨苄西林残留量的测定方法与流程

本发明属于药品质量检测领域，具体涉及一种重组霍乱毒素b亚单位中氨苄西林残留量的测定方法。

背景技术：

1、氨苄西林，又称氨苄青霉素，是一种有机化合物，化学式为c16h19n3o4s，是一种β-内酰胺类抗生素，对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均具有抑制作用，可治疗多种由细菌引起的感染。适应症包含呼吸道感染、泌尿道感染、脑膜炎、沙门氏菌感染症，以及心内膜炎。也能用于预防新生儿的b群链球菌感染，可经由口服、肌肉注射以及静脉注射给药。

2、

3、氨苄西林在1961年首次被发现，现列于世界卫生组织基本药物标准清单中，是基础公卫体系必备药物之一。在的生产过程中，使用到了氨苄西林，抗生素在人体长期积累会对人体健康产生一定的危害，通过一系列的纯化手段，最终产品中应不含抗生素残留，因此需要测定重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林的残留量，以此对药品质量进行控制。

4、现行重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林残留量的检测依据的是《中国药典》2020年版三部通则3408抗生素残留量检测法(培养法)进行分析检测，依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，判定供试品溶液是否有抗生素残留，该方法检测限较高，无法满足现有样品的分析检测。相比培养法，液相色谱法具有灵敏，稳定性好，重现性好等优势。

5、中国兽药杂志，2002,36(12):21～23，公开了牛奶中氨苄青霉素残留检测方法研究，用三氯乙酸溶液沉淀牛奶蛋白并提取氨苄青霉素残留，在酸性条件下，提取液中的氨苄青霉素与甲醛加热生成2-羟基-3-苯基-6-甲基吡嗪(氨苄青霉素荧光衍生物)，用带有荧光检测器的高效液相色谱仪在激发波长(ex)346nm、发射波长(em)420nm条件下测定该衍生物，外标法定量。该方法简单、快速、灵敏度高，最低检测限为1μg/l，最低定量限为2μg/l，回收率为70％～110％，批内变异系数在10％以内，批间变异系数小于15％。但是按该检测方法检测重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林残留量，结果并不理想。

6、因此开发一种液相色谱测定法对重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林残留量进行检测，具有研究的必要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种重组霍乱毒素b亚单位中氨苄西林残留量的测定方法，具体为一种重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林残留量高效液相色谱测定方法。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、一种重组霍乱毒素b亚单位中氨苄西林残留量的测定方法，所述测定方法为高效液相色谱法，高效液相色谱的检测条件包括：

4、流动相：a相为体积比为2-4:1的0.008-0.012mol/l磷酸二氢钾溶液与乙腈混合液，其中磷酸二氢钾溶液用磷酸调节ph至2.95-3.05，体积比优选为3:1；b相为乙腈；

5、洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序为：0-8min，100％流动相a，0％流动相b；8-10min，80％流动相a，20％流动相b；10-13min，80％流动相a，20％流动相b；13-15min，100％流动相a，0％流动相b；15-25min，100％流动相a，0％流动相b。

6、优选地，所述测定方法具体包括如下步骤：

7、(1)分别取标准溶液和待测样品溶液，加入三氯醋酸水溶液、甲醛溶液和乙腈水溶液，混匀，得到标准衍生化溶液和待测样品衍生化溶液；

8、(2)通过高液相色谱对标准衍生化溶液和待测样品衍生化溶液进行分离及测定。

9、进一步优选地，根据测试结果计算得到氨苄西林含量。

10、优选地，步骤(2)中标准衍生化溶液和待测样品衍生化溶液的配制过程包括：分别在标准溶液和待测样品溶液中，加入三氯醋酸水溶液振荡2-3min，3800-4200rpm离心8-12min，取上清液，加入甲醛溶液混匀30-40s，85-100℃加热28-32min，冷却至室温，加入乙腈水溶液，混匀，即得。

11、进一步优选地，三氯醋酸水溶液的体积浓度为73％-77％，甲醛溶液的体积浓度为8％-10％，乙腈水溶液的体积浓度为18％-22％，三氯醋酸水溶液与标准溶液或待测样品溶液的体积比为0.8-1.2:1，上清液与甲醛溶液、乙腈水溶液的体积比为10:0.8-1.2:8.8-9.2。

12、优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：色谱柱为acquity uplcc18柱。

13、进一步优选地，所述acquity uplcc18柱的规格为：内径2.1mm×长度150mm，粒径1.7μm。

14、优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为25-30℃。

15、优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：流速：0.2±0.02ml/min，进样量：30-40μl。

16、优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括检测波长：激发波长为347nm，发射波长为430nm。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、(1)本发明检测方法准确度和精密度较高；

19、(2)本发明使用acquity uplcc18色谱柱，通过特定的洗脱程序，最终实现高效检测重组霍乱毒素b亚单位及工艺中间体样品中氨苄西林残留量，该方法操作简单，成本低。

技术特征：

1.一种重组霍乱毒素b亚单位中氨苄西林残留量的测定方法，其特征在于，所述测定方法为高效液相色谱法，高效液相色谱的检测条件包括：

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中标准衍生化溶液和待测样品衍生化溶液的配制过程包括：分别在标准溶液和待测样品溶液中，加入三氯醋酸水溶液振荡2-3min，3800-4200rpm离心8-12min，取上清液，加入甲醛溶液混匀30-40s，85-100℃加热28-32min，冷却至室温，加入乙腈水溶液，混匀，即得。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，三氯醋酸水溶液的体积浓度为73％-77％，甲醛溶液的体积浓度为8％-10％，乙腈水溶液的体积浓度为18％-22％，三氯醋酸水溶液与标准溶液或待测样品溶液的体积比为0.8-1.2:1，上清液与甲醛溶液、乙腈水溶液的体积比为10:0.8-1.2:8.8-9.2。

5.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：色谱柱为cshtm c18柱。

6.据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述cshtm c18柱的规格为：内径2.1mm×长度150mm，粒径1.7μm。

7.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为25-30℃。

8.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：流速：0.2±0.02ml/min，进样量：30-40μl。

9.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括检测波长：激发波长为347nm，发射波长为430nm。

技术总结
本发明属于药品质量检测领域，具体涉及一种重组霍乱毒素B亚单位中氨苄西林残留量的测定方法。其中，高效液相色谱的检测条件包括：流动相：A相为体积比为2‑4:1的0.008‑0.012mol/L磷酸二氢钾溶液与乙腈混合液，磷酸二氢钾溶液用磷酸调节pH至2.95‑3.05；B相为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序为：0‑8min，100％流动相A，0％流动相B；8‑10min，80％流动相A，20％流动相B；10‑13min，80％流动相A，20％流动相B；13‑15min，100％流动相A，0％流动相B；15‑25min，100％流动相A，0％流动相B。本发明检测方法准确度高且精密度高。

技术研发人员：周永丹,闻宏亮,孙如玉,刘浩,张梦悦
受保护的技术使用者：上海联合赛尔生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17