一种增强靶向检测目标蛋白信号的免疫磁珠及其制备方法和用途

本发明属于生物检测，具体涉及一种增强靶向检测目标蛋白信号的免疫磁珠及其制备方法和用途。

背景技术：

1、蛋白质是有吸引力的疾病生物标志物候选者，因为与其他生物标志物如mirna相比，其能提供更多关于细胞或组织的实际生理状态的信息。将生物标志物发现转化为分析检测并最终转化为稳健的临床测定是一个具有挑战性的问题。结合抗体选择性和质谱仪的精确度和准确度的优势是解决阻碍大规模临床生物标志物测定经常采用的一种方法。

2、人类的体液（特别是血液）是诊断分析时常用的临床样本，因样本采集过程中微创且低风险，便于在疾病过程中进行连续检测，因此在临床诊断中普遍使用。体液样本的复杂性为蛋白质组的研究带来巨大的困难，存在诸如高丰度蛋白含量占比高、动态范围大，蛋白种类复杂等问题。

3、目前对于目标蛋白的特异性检测通常使用免疫沉淀（immunoprecipitation，ip）技术和免疫磁珠（immunomagnetic bead, imb）。免疫沉淀技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质相互作用、或者蛋白质与遗传物质之间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，也是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一。免疫沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。免疫沉淀的成功依赖于抗原的纯度以及制备抗体的难易，主要受以下两方面因素的影响：抗原原液的丰度以及抗体对抗原的亲和力。免疫磁珠技术是20世纪80年代出现的技术方法，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面有着越来越广泛的使用。免疫磁珠运用核-壳的合成方法合成含有超顺磁性物质的高分子表面覆盖的复合材料、稳定性好、能进行后期标记的物质，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、巯基等进行抗体的共价或者非共价偶联，可用于结合相应的抗原或抗体，这样在外加磁场的吸引下可做定向移动，从而达到分离，检测，纯化基因、蛋白质、细胞、微生物等的目的。然而，免疫磁珠带来的非特异性吸附也对靶向蛋白检测提出了巨大挑战。

4、目前，全世界发光免疫磁珠的市场份额主要被thermofisher的dynabeads系列占领，其余常用品牌还有日本jsr、英国agilent、美国ge等。与进口产品相比，国产磁珠主要差距体现在整体性能（尤其是非特异吸附高）及存储稳定性、批间差异以及量产能力等多个方面。因此，亟待研发出适于我国国情的灵敏度高、非特异性吸附低、储存稳定性高、批间差异小、量产能力强、制备方法简单且价格低廉的增强靶向检测目标蛋白信号的新型国产免疫磁珠。

5、氧化石墨烯（graphene oxide，go）是将石墨氧化后经过超声剥离、分散、粉碎后得到的片层状物质，从化学结构上看go是石墨烯的氧化产物，与石墨烯相同的是其结构单元具有由c原子构成六元环状结构，go本身具有高比表面积，使复合材料的比表面积相对于单个磁核的球形磁珠有所提高，增加了可结合位点，提高结合效率。目前常将氧化石墨烯基膜用于废水净化领域，但是尚无将go用于制备免疫磁珠方面的报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的缺陷以及填补现有技术的空白，本发明首次将tmao聚合物包裹在go这种二维纳米材料基底磁珠上，提供了一种增强靶向检测目标蛋白信号的新型免疫磁珠及其制备方法和用途。

2、具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

3、在第一个方面中，本发明提供了一种增强靶向检测目标蛋白信号的免疫磁珠，所述免疫磁珠由go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠与生物配体共价偶联制备得到。

4、作为可选的方式，在上述免疫磁珠中，所述免疫磁珠由go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠表面活化的羧基与带有伯胺基的生物配体共价偶联制备得到。

5、作为可选的方式，在上述免疫磁珠中，所述生物配体可以是根据生物检测的实际需要选择的任何特异性抗体，只要其能与go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠共价偶联即可。

6、例如，可以使用特异性针对il-6、il-1β、il-10的抗体。

7、在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的免疫磁珠的制备方法，所述制备方法包括go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠的制备和免疫磁珠的制备。

8、作为可选的方式，在上述制备方法中，所述go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠的制备包括以下步骤：

9、（1）磁性go-fe3o4的制备：

10、称取10-50 mg go纳米材料，溶解于10-50 ml乙二醇中，超声至均匀分散状态，加入100-200 mg fecl3·6h2o和10-50 mg柠檬酸三钠，超声至完全溶解，继续加入500-1000mg无水乙酸钠，将所得分散均匀的溶液转入30 ml teflon高压反应釜，150-250℃反应8 h以上，得到的磁珠用乙醇与水各洗3次烘干，即得到产物go-fe3o4；

11、（2）氧化三甲胺（tmao）的制备：

12、在搅拌下将500-1000 mg二乙烯三胺五乙酸（dtpa）加入到10-50 ml去离子水中，继续搅拌使白色粉末完全溶解，向溶液中缓慢加入1-5 ml 30%双氧水（h2o2），反应加热至30-80℃，在5-20 ml超纯水中溶解10-20 g二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺（dmapma），搅拌下滴加入，在30 min内加入，在30-80℃下反应5-8 h，反应结束后，待反应物完全冷却后，将溶液加入丙酮中，弃上清，得到底部的粘性液体tmao，最后，用乙醚再次洗涤粘性液体；

13、（3）go-fe3o4@sio2@mps的制备：

14、将10-50 mg go-fe3o4加入到20-50 ml乙醇和5-20 ml去离子中，机械搅拌，在溶液中加入0.5-5 ml mps、1-5 ml氨水和200-300 μl teos孵育2-5 h，将混合溶液加热至50-80℃，反应3-6 h，产物分别用水和乙醇洗涤3次，得到go-fe3o4@sio2@mps；

15、（4）go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠的制备：

16、将10-50 mg go-fe3o4@sio2@mps加入到含有20-60 ml乙腈、0.2-1 ml tmao、50-80mg甲基丙烯酸（maa）、20-80 mg n,n'-亚甲基丙烯酰胺（mba）和5-30 mg 2,2’-偶氮二（2-甲基丙腈）（aibn）的混合物中，将混合体系加热至100-120℃，搅拌反应20-40 min，最后用水与乙醇交替洗涤三次，干燥称重，加超纯水制备成磁珠悬浮液。

17、作为可选的方式，在上述制备方法中，所述go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠的制备包括以下步骤：

18、（1）磁性go-fe3o4的制备：

19、称取30 mg go纳米材料，溶解于30 ml乙二醇中，超声至均匀分散状态，加入160mg fecl3·6h2o和30 mg柠檬酸三钠，超声至完全溶解，继续加入700 mg无水乙酸钠，将所得分散均匀的溶液转入30 ml teflon高压反应釜，200℃反应8 h以上，得到的磁珠用乙醇与水各洗3次烘干，即得到产物go-fe3o4；

20、（2）氧化三甲胺（tmao）的制备：

21、在搅拌下将800 mg二乙烯三胺五乙酸（dtpa）加入到30 ml去离子水中，继续搅拌使白色粉末完全溶解，向溶液中缓慢加入4.31 ml 30%双氧水（h2o2），反应加热至60℃，在10ml超纯水中溶解14.4 g二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺（dmapma），搅拌下滴加入，在30 min内加入，在60℃下反应6 h，反应结束后，待反应物完全冷却后，将溶液加入丙酮中，弃上清，得到底部的粘性液体tmao，最后，用乙醚再次洗涤粘性液体；

22、（3）go-fe3o4@sio2@mps的制备：

23、将30 mg go-fe3o4加入到40 ml乙醇和10 ml去离子中，机械搅拌，在溶液中加入1ml mps、4 ml氨水和240 μl teos孵育2-5 h，将混合溶液加热至70℃，反应5 h，产物分别用水和乙醇洗涤3次，得到go-fe3o4@sio2@mps；

24、（4）go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠的制备：

25、将30 mg go-fe3o4@sio2@mps加入到含有40 ml乙腈、0.5 ml tmao、70 mg甲基丙烯酸（maa）、60 mg n,n’-亚甲基丙烯酰胺（mba）和10 mg 2,2’-偶氮二（2-甲基丙腈）（aibn）的混合物中，将混合体系加热至110℃，搅拌反应30 min，最后用水与乙醇交替洗涤三次，干燥称重，加超纯水制备成10 mg/ml磁珠悬浮液。

26、作为可选的方式，在上述制备方法中，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：先将go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠表面的羧基活化，再将带有伯胺基的生物配体与表面羧基已活化的go-fe3o4@sio2@ptmao@cooh磁珠共价偶联，以获得所述免疫磁珠。

27、在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的免疫磁珠或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的免疫磁珠在对目标蛋白进行靶向检测的生物检测方法中的用途。

28、在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的免疫磁珠或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的免疫磁珠在制备对目标蛋白进行靶向检测的生物检测试剂盒中的用途。

29、作为可选的方式，在上述用途中，所述生物检测的样品包括但不限于血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、肺泡灌洗液、痰液、腹水、汗液、泪液、胸水或组织间液。

30、优选地，所述生物检测样品是血液。

31、在第五个方面中，本发明提供了一种增强靶向检测目标蛋白信号的生物检测方法，所述生物检测方法将上述第一个方面所述的免疫磁珠或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的免疫磁珠与质谱检测技术结合，从而增强靶向检测目标蛋白的信号。

32、作为可选的方式，在上述生物检测方法中，所述质谱技术包括以下步骤：

33、（1）采用质谱检测对已富集了目标蛋白的所述免疫磁珠进行质谱上样分析；

34、（2）使用蛋白分析软件对步骤（1）中生成的质谱检测原始数据进行数据检索分析。

35、优选地，所述蛋白分析软件可以选自本领域公知的各种蛋白分析软件，例如spectrodive或skyline等软件。

36、作为可选的方式，在上述生物检测方法中，所述质谱技术包括以下步骤：

37、（1）采用lc-ms/ms对已富集了目标蛋白的所述免疫磁珠进行质谱上样分析；

38、（2）使用spectrodive对步骤（1）中生成的质谱检测原始数据进行数据检索分析。

39、本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

40、本发明合成了一种以go为基底材料，fe3o4为磁核，表面修饰ptmao的羧基磁珠，通过共价偶联生物配体用于样品中生物标志物的高效富集。本发明一是通过go这种二维纳米材料增加复合材料的比表面积，增加结合位点，提高结合效率，二是引入ptmao修饰，有效降低靶向检测非特异吸附，结合质谱检测技术，显著提高了靶向蛋白检测信号。本发明所述免疫磁珠具有灵敏度高、非特异性吸附低、储存稳定性高、批间差异小、量产能力强、制备方法简单且价格低廉等诸多优点，具有较高的临床应用价值和市场经济价值。