检测游离VEGF的方法与流程

本申请涉及生物样品检测领域。具体地，本申请涉及检测生物样品中的游离vegf。

背景技术：

1、湿性年龄相关性黄斑变性（amd）又称新生血管性amd，其与新血管的生成有很大的相关性，以脉络膜新生血管（cnv）的形成为特征，占amd发病率的20%，虽然比例不大，但却是90%以上患者视力损害的主要原因。湿性amd可合并眼底出血和渗出，进而发生瘢痕化，破坏黄斑结构，影响视功能。湿性amd进展迅速，如不治疗，40%以上的患者5年内会双眼发生病变。该类患者中有~90%左右的患者视力障碍多由渗出物引起。

2、新血管的生成与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）相关。vegf又称血管通透因子（vascular permeability factor，vpf），其为高度特异性的一种促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，包括vegf-a、vegf- b、vegf- c、vegf- d、vegf- e(病毒编码)和胎盘生长因子(pigf)。vegf-c和vegf-d主要参与淋巴管生成的调节。鉴于vegf- a在调节血管生成和疾病中的主导作用，且是生理上最相关的vegf亚型。新血管的生成可将营养物质运输到组织和器官并清除代谢产物，故其对维持机体稳态作用起着关键的作用。然而，不受控制的血管生长能赋予肿瘤细胞生长优势，也可促进糖尿病视网膜病变。

3、临床研究表明，在雷尼单抗（lucentis，genentech）给药组中观察到微小的可能与全身vegf抑制相关的严重不良事件发生率的趋势，反映出严重动脉血栓栓塞事件的趋势，并且在较小程度上反映了严重非眼出血的趋势。而且，观察到每月0.5mg雷尼单抗治疗的受试者与其他受试者相比，严重动脉血栓栓塞事件的总体趋势略有增加。故检测在给药后对vegf的抑制水平对安全性有一定的指示作用。

4、目前，商品化的试剂盒灵敏度为15.6pg/ml，且无法确定是否为游离的vegf。因此，需要建立一种可以检测游离vegf的方法，用于指示vegf单抗药物以及vegf trap类药物的药效和不良事件发生率的关系。

技术实现思路

1、第一方面，本申请提供了一种检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的vegf的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的vegf以及游离的vegf，所述方法包括：

2、(1) 将贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普固定在固相上；

3、(2) 向步骤(1)的固相上加入施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品；

4、(3) 向步骤(2)的血液样品中加入带有可检测标记的抗vegf抗体，所述带有可检测标记的抗vegf抗体与vegf的结合表位与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与vegf的结合表位不重叠；

5、(4) 检测所述可检测标记的强度以确定所述血液样品中的游离的vegf的含量。

6、在一些实施方案中，所述可检测标记是生物素。

7、在一些实施方案中，检测所述可检测标记的强度还包括加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

8、在一些实施方案中，步骤(3)中的抗vegf抗体是人vegf165抗体。

9、在一些实施方案中，步骤(3)中的带有可检测标记的抗vegf抗体是人vegf165生物素化抗体，即生物素化抗vegf抗体baf293。

10、在一些实施方案中，贝伐珠单抗是安维汀。

11、在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。

12、在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。

13、在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。

14、在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。

15、在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。

16、在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。

17、在一些实施方案中，步骤(1)中的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的vegf与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普的结合。

18、在一些实施方案中，所述带有可检测标记的抗vegf抗体结合vegf的结合位点与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合vegf的结合位点不同，且带有可检测标记的抗vegf抗体与vegf的结合不影响固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与vegf的结合。

19、在一些实施方案中，贝伐珠单抗、雷尼单抗和阿柏西普中的任一种与vegf的结合阻止了固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与所结合的vegf的结合。

20、第二方面，本申请提供了贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的vegf的用途。

技术特征：

1.检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的vegf的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的vegf以及游离的vegf，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记是生物素。

3.如权利要求2所述的方法，其中检测所述可检测标记的强度还包括加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的抗vegf抗体是人vegf165抗体。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的带有可检测标记的抗vegf抗体是生物素化抗vegf抗体baf293。

6.如权利要求1所述的方法，其中，

7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的vegf与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普的结合。

8.如权利要求1所述的方法，其中带有可检测标记的抗vegf抗体与vegf的结合不影响固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与vegf的结合。

9.如权利要求1所述的方法，其中贝伐珠单抗、雷尼单抗和阿柏西普中的任一种与vegf的结合阻止了固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与所结合的vegf的结合。

10.贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离vegf的用途。

技术总结
本申请提供了一种检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF以及游离的VEGF。本申请还提供了贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离VEGF的用途。

技术研发人员：王变珍,李弯弯,王琪
受保护的技术使用者：军科正源（北京）药物研究有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7