一种石蜡标本中肾小球裂隙膜的三维可视化方法与流程

本发明涉及组织荧光染色，特别是涉及一种石蜡标本中肾小球裂隙膜的三维可视化方法。

背景技术：

1、肾小球裂隙膜（slit diaphragm）是肾小球毛细血管上皮细胞上的一种特殊结构，具有重要的生理功能。它位于毛细血管上皮细胞的突起之间，呈拉链状，形成了最后一层滤过屏障，对于肾小球的滤过功能和选择性通透性起着至关重要的作用。首先，它允许血液中的水分和溶质能够被过滤到肾小球囊内，成为原尿的一部分。这种选择性的通透性使得裂隙膜能够有效地阻止大分子蛋白质等物质通过，从而维持了体液的渗透压和离子平衡。其次，肾小球裂隙膜在调节肾小球滤过率和血液动力学方面也发挥着重要作用。通过调节裂隙膜的通透性和表面电荷，肾脏能够根据机体的需要对滤过率进行动态调节，以维持血液中各种成分的稳定浓度。此外，肾小球裂隙膜也参与了一些疾病的发生和发展，例如肾小球肾炎等。疾病状态下，裂隙膜的结构和功能可能会受到损害，导致蛋白尿、血尿等症状的出现。

2、肾小球裂隙膜由多种蛋白质组成，其中包括nephrin和podocin。nephrin是一种重要的跨膜蛋白，主要存在于肾小球的足细胞（podocyte）的细胞膜上。它通过其胞外结构与相邻足细胞结合，形成了肾小球裂隙膜的重要组成部分。nephrin的存在有助于维持裂隙膜的结构完整性，同时也参与了信号传导和细胞间的黏附作用，对于维持肾小球滤过屏障的正常功能至关重要。另一方面，podocin是一种与nephrin相互作用的蛋白质，主要存在于足细胞的细胞膜上。podocin与nephrin结合形成了一种重要的蛋白质复合体，这种复合体对于维持肾小球滤过屏障的结构和功能至关重要。总体来说，nephrin和podocin作为肾小球裂隙膜的重要组成部分，维持了肾小球滤过屏障的结构完整性和功能稳定性。它们的异常表达或功能缺陷可能导致肾小球疾病的发生和发展，因此对于肾小球正常的生理功能具有重要意义。

3、肾小球裂隙膜的宽度是非常微小的，通常在20至50纳米的范围内，通过扫描电镜观察为拉链样连续结构，但是在临床上透射电镜（厚度为50~70nm）只能观察到横断面的点状结构，并不能看到其连续形态；另外裂隙膜的结构微小，通过透射电镜的观察依赖锇酸的染色，如果染色较浅，不易识别。因此，尽管电镜观察是临床上常用的观察肾小球超微结构的一项技术，但通过它观察裂隙膜结构存在以下限制和不足之处：1、二维结构的限制：电镜制样后用于观察的超薄切片是70nm左右，受限于切片的角度，只能观察到裂隙膜的横断面结构，而裂隙膜的三维结构是复杂的，连续的，像拉链样结构，这些在超薄切片图像中无法完全展现；2、样本的限制：受限于电镜标本本身，电镜超薄切片通常只有1~2个肾小球，用于石蜡肾活检组织有15~25个肾小球，因此不能全面评估滤过膜受损情况；3、样本处理的挑战：电镜样本的固定、切片制备和染色等步骤需要高度的技术技能和繁复的操作，不恰当的样本处理如染色过浅导致裂隙膜染色不够影响病理医师对裂隙膜的观察；4、临床评估不足：由于电镜图像中显示的裂隙膜是横断面结构，因此并不能够给临床病理学家评估蛋白尿患者的滤过膜损伤提供太多信息，导致目前肾活检穿刺标本超微结构的观察对象很少涉及裂隙膜。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种石蜡标本中肾小球裂隙膜的三维可视化方法。本发明提供的方法经热修复处理和染色后可直接在共聚焦显微镜下实现肾活检石蜡标本的肾小球裂隙膜形态的观察，包括观察肾小球的面积和/或肾小球裂隙膜的长度。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种辅助观察肾小球裂隙膜形态的方法，包括如下步骤：

4、使用热修复处理肾组织石蜡切片，封闭，得到封闭处理的组织切片；所述热修复处理组织切片的时间为9~11min，所述热修复处理组织切片的试剂包括edta；

5、依次用nephrin抗体和alexa fluor 594-羊抗鼠抗体孵育所述封闭处理的组织切片，封片，得到封片的组织切片；

6、将所述封片的组织切片置于共聚焦显微镜下观察肾小球裂隙膜形态；所述肾小球裂隙膜形态包括肾小球的面积和/或肾小球裂隙膜的长度。

7、优选的，所述nephrin抗体购自proteintech公司，货号为66970-1-ig。

8、优选的，所述热修复处理包括：将肾组织石蜡切片放入热修复处理组织切片的试剂中，在高压锅中隔水加热9~11min。

9、优选的，所述nephrin抗体和alexa fluor 594-羊抗鼠抗体经pbs溶液稀释后使用。

10、优选的，所述nephrin抗体的稀释比例为1：600~1：1000；

11、所述alexa fluor 594-羊抗鼠抗体的稀释比例为1：200~1：400。

12、优选的，所述封闭的试剂包括体积浓度为10%的山羊血清，封闭的时间为50~60min。

13、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

14、（1）采用本发明的方法进行肾小球裂隙膜染色，抗体敏感性和特异性均较好，能够标记所有的肾小球裂隙膜，从而实现三维结构的观察，不仅包括临床上透射电镜标本可观察到的横断面点状结构，还包括科学研究中扫描电镜观察到的连续结构。

15、（2）相比于电镜标本需要额外的组织和制样而言，本发明的方法无需额外的标本，可直接使用常规石蜡包埋的组织切片，使用间接免疫荧光完成染色，节省了标本取材和制样时间。

16、（3）本发明的方法免疫染色过程简单，为常用的间接免疫染色技术，对技术员的要求低，可行性高。

17、（4）使用本发明的方法对肾小球裂隙膜进行染色后，能够最大化利用肾脏标本，纳入全部肾小球来全面评估肾小球裂隙膜受损情况。

18、（5）利用本发明提供的方法染色后的组织切片在成像时，使用共聚焦显微镜即可获得足够的分辨率，提高了效率，节约了成本。

技术特征：

1.一种辅助观察肾小球裂隙膜形态的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述nephrin抗体购自proteintech公司，货号为66970-1-ig。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热修复处理包括：将肾组织石蜡切片放入热修复处理组织切片的试剂中，在高压锅中隔水加热9~11min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述nephrin抗体和alexa fluor 594-羊抗鼠抗体经pbs溶液稀释后使用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述nephrin抗体的稀释比例为1：600~1：1000；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述封闭的试剂包括体积浓度为10%的山羊血清，封闭的时间为50~60min。

技术总结
本发明涉及组织荧光染色技术领域，特别是涉及一种石蜡标本中肾小球裂隙膜的三维可视化方法。本发明对肾活检组织石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭处理后依次使用一抗、二抗进行免疫标记处理，再进行封片即可完成肾脏肾小球裂隙膜免疫荧光染色，然后通过超分辨激光共聚焦显微镜进行成像。利用本发明的方法进行肾小球裂隙膜染色和成像，能够可视化肾小球裂隙膜的三维结构，包括横断面结构和连续结构。通过共聚焦图像可观察到疾病状态下和缓解状态下的裂隙膜形态的改变，为评估肾小球滤过屏障的功能以及探究滤过屏障的重塑过程中裂隙膜的特征性改变提供直接的证据。

技术研发人员：李文歌,刘晓静
受保护的技术使用者：中日友好医院（中日友好临床医学研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17