一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法与流程

本发明涉及微生物和微流控，尤其涉及一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法。

背景技术：

1、重组蛋白市场一般包括蛋白治疗剂、诊断蛋白和工业酶三个方向，全球重组蛋白市场从2015年的70亿美元增长至2020年的108亿美元，预计2025年市场规模有望突破200亿美元，呈现蓬勃发展态势。随着中国生物制药行业的日益发展，国内重组蛋白市场发展势头强劲。在重组蛋白市场中，大约有20%~30%的生物治疗产品和工业酶是由酵母生产得到。与细菌和哺乳动物生产宿主相比，酵母结合了微生物和高等真核表达系统的一系列优势，包括发酵简单、快速、便宜，易于遗传操作，具有蛋白质翻译后修饰功能，可分泌表达，纯化工艺简单而且安全等。为了提高异源蛋白表达量及分泌效率，往往需要对酵母表达系统进行优化，现有技术中一般通过平板筛选方法或流式细胞术获得高性能菌株。平板筛选方法耗时长，成本高，通量低，不能快速获得高性能菌株，而流式细胞术难以检测胞外分泌的异源蛋白，二者均很难兼顾收益和效果的平衡。

2、微流控荧光激活液滴分选技术可以对酵母单个细胞进行包裹，并通过分泌异源蛋白产量进行荧光定量，根据荧光信号筛选出高性能菌株。该筛选方法具有体积小、通量高和特异性强特点，其应用难点在于通过分泌的异源蛋白产量进行荧光定量。

3、中国专利cn111718862b公开了基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法，通过构建毕赤酵母菌株、毕赤酵母菌株突变体库、对毕赤酵母菌株突变体库种的菌株进行单液滴包埋和液滴培养，得到含有毕赤酵母菌株突变体的液滴、根据液滴内荧光的强度进行液滴微流控分选，筛选出液滴、对液滴分别进行摇瓶发酵及复筛，得到分泌木聚糖酶能力提高的毕赤酵母菌株。

4、中国专利cn108485984a公开了纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法，包括：步骤一、将纤维素酶产生菌的孢子置于湿室培养，直至孢子萌动至接近萌发的状态结束湿室培养；步骤二、采用液滴微流控技术将孢子、培养基以及纤维素酶标记底物包埋于液滴中，进行预培养，在孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘之前结束预培养；步骤三、检测液滴内的荧光，根据液滴内的荧光强度进行液滴微流控分选，筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴；步骤四、对分选后的液滴中的孢子进行纯培养及复筛，以筛选出纤维素酶高产菌株。

技术实现思路

1、本发明提供了一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

2、s1.液滴生成：试剂相与酵母相在微流体生成芯片中混合时被油相切割，得到液滴；

3、s2.液滴孵育：液滴在20-30℃环境孵育12-36h，直至液滴中能够观察到荧光聚集；

4、s3.液滴分选：将液滴、隔离油、平衡油注入微流体分选芯片，激光扫描液滴，光电倍增管读取荧光信号，通过阈值分选收集阳性液滴；

5、所述试剂相包括微球和荧光抗体。

6、进一步地，所述荧光抗体可与异源分泌蛋白结合，用于指示分泌蛋白聚集在微球表面。

7、在一些实施方式中，所述微球需要进行预处理，所述预处理包括将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体共孵育，和/或，所述微球为链霉亲和素聚苯乙烯微球。

8、进一步地，将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体在旋转仪上室温孵育1h，用于后续结合异源分泌蛋白。

9、在一些实施方式中，所述酵母相为单细胞酵母悬液。

10、在一些实施方式中，在s1的液滴生成中，被油相切割后得到的液滴为独立的反应腔室，单细胞酵母在液滴中分泌异源蛋白，异源蛋白与试剂相反应，导致荧光聚集在微球表面。

11、在一些实施方式中，所述试剂相与酵母相中加入悬浮液添加剂，和/或，所述酵母相中加入细胞保护剂。

12、在一些实施方式中，所述悬浮液添加剂为optiprep，所述细胞保护剂pluronicf-68。

13、在一些实施方式中，所述液滴在20-30℃环境孵育12-36h后，需要在显微镜下观察液滴中微球聚集荧光的情况，若荧光信号明显则用于后续液滴分选；若荧光信号较弱，则继续孵育，直至微球出现较强的荧光信号。

14、在一些实施方式中，在s3的液滴分选中，若液滴中荧光信号超过分选阈值，则对液滴施加电场，液滴发生偏转进入收集流道；若液滴中荧光信号未超过分选阈值，则液滴进入废弃流道。

15、在一些实施方式中，所述s1中油相的流速为450-800μl/h，试剂相的流速为150-400μl/h，酵母相的流速为150-400μl/h。

16、申请人在研发中发现，流速过高会导致液滴生成不稳定，流速过低导致液滴生成速度缓慢。相对于现有技术，本发明的液滴生成速度快。

17、在一些实施方式中，所述s3中分选的参数：方波数8-30，输出频率8-13khz，延迟时间0us，分选电压1000-1200v。

18、在实际操作中，设定参数不在上述限定的范围内，会导致液滴无法正确分选，如阳性液滴进入废液流道，或阴性液滴进入收集流道。相对于现有技术，本发明的分选准确率高。

19、在一些实施方式中，所述s3中隔离油的流速为600-1500μl/h，平衡油的流速为400-1000μl/h，液滴的流速为80-200μl/h。

20、在筛选过程中，流速过大会导致液滴无法正常分选，流速过低会导致分选速度降低。相对于现有技术，本发明的液滴分选速度快。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、1.本发明可以在单个酵母水平上对异源分泌蛋白进行快速、高效和可靠的动力学分析。

23、2.本发明可以高通量完成分泌蛋白质和菌株的定向进化，筛选百万级酵母菌株仅需2~5 h，荧光试剂仅需1~6 μl，大幅度降低试剂成本。

24、3.相较于cn111718862b，本发明筛选百万级别菌株耗时更短，仅为其时长的1/5-1/2；且本发明筛选百万级别菌株试剂消耗更少；此外，相对于其需要构建外源蛋白融合荧光蛋白的酵母菌株，本发明不需要对酵母菌株进行任何工程化改造，可直接筛选突变库菌株，降低了筛选复杂性和困难度。

25、4．相较于cn108485984a的筛选通量为104突变体/天，本发明筛选通量是其通量的100倍以上。

技术特征：

1.一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微球需要进行预处理，所述预处理包括将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体共孵育，和/或，所述微球为链霉亲和素聚苯乙烯微球。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母相为单细胞酵母悬液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在s1的液滴生成中，被油相切割后得到的液滴为独立的反应腔室，单细胞酵母在液滴中分泌异源蛋白，异源蛋白与试剂相反应，导致荧光聚集在微球表面。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂相与酵母相中加入悬浮液添加剂，和/或，所述酵母相中加入细胞保护剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述悬浮液添加剂为optiprep，所述细胞保护剂pluronicf-68。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s3的液滴分选中，若液滴中荧光信号超过分选阈值，则对液滴施加电场，液滴发生偏转进入收集流道；若液滴中荧光信号未超过分选阈值，则液滴进入废弃流道。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中油相的流速为450-800μl/h，试剂相的流速为150-400μl/h，酵母相的流速为150-400μl/h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s3中分选的参数：方波数8-30，输出频率8-13khz，延迟时间0us，分选电压1000-1200v。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s3中隔离油的流速为600-1500μl/h，平衡油的流速为400-1000μl/h，液滴的流速为80-200μl/h。

技术总结
本发明涉及微生物和微流控技术领域，尤其涉及一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：S1.液滴生成；S2.液滴孵育；S3.液滴分选。本发明可以在单个酵母水平上对异源分泌蛋白进行快速、高效和可靠的动力学分析，还可以高通量完成分泌蛋白质和菌株的定向进化，筛选百万级酵母菌株仅需2~5 h，荧光试剂仅需1~6μL，大幅度降低试剂成本。

技术研发人员：王蔚,李元元,朱玥玮,裴颢
受保护的技术使用者：墨卓生物科技（浙江）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22