本技术涉及血型检测领域，更具体地说，它涉及一种rh血型基因检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
1、随着医学技术的不断发展，rh血型检测作为临床医学中不可或缺的一部分，对于保障输血安全、妊娠期间的管理以及其他相关医疗操作具有重要意义。然而，rh血型检测过程中仍然存在着一些难点，如确保准确性、灵敏度和可靠性等方面的挑战。
2、目前，常用的rh血型基因检测技术主要为多从引物特异性pcr法(pcr+ssp)和荧光pcr法。在pcr+ssp法中，pcr用于扩增特定的dna片段，而ssp用于检测扩增产物中是否含有目标序列，该方法具有高度的特异性和灵敏度，可以有效地检测出rh基因的不同等位基因，从而确定个体的rh血型。荧光pcr是一种在pcr过程中引入荧光标记的方法，可以实现实时监测pcr产物的形成。在rh血型检测中，荧光pcr可以用于检测与rh基因相关的特定dna片段，从而确定个体的rh血型，荧光pcr检测rh血型具有高度的特异性和灵敏度，同时还可以在pcr反应进行过程中实时监测产物的形成，因此可以提供快速而准确的rh血型检测结果。
3、然而，上述两种方法在对rh血型基因检测的具体使用过程中，常常会存在一些缺陷：pcr+ssp法和荧光pcr法均需要进行基因扩增再检测，检测耗时长，且扩增产物容易产生气溶胶污染，尤其是pcr+ssp法还存在核酸染料污染的安全问题。
技术实现思路
1、为了克服上述技术问题，本技术提供一种rh血型基因检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒采用光激化学发光技术，利用引物序列特异性抗体分别针对rhc/c的变异位点c.307t>c和rhe/e的变异位点c.676c>g，可实现靶基因rh血型的检测，具有检测周期短、安全性高、高灵敏度、低成本的特点。
2、本技术提供采用如下的技术方案：
3、第一方面，本技术提供一种rh血型基因检测试剂盒，其包括第一抗体偶联的发光微球、生物素标记的第二抗体、链酶亲和素修饰的感光微球以及分析缓冲液；
4、第一抗体为四种分别针对rhc/c变异位点c.307t>c和rhe/e变异位点c.676c>g的序列特异性抗dna抗体；第二抗体为特异性识别第一抗体的羊抗抗dna抗体；
5、发光微球中包被有二甲基α-氯甲基噻吩、二甲基咪唑和二氧化丁二烯-过度金属螯合物；
6、感光微球上修饰有荧光物质。
7、该试剂盒的检测原理是：
8、通过在均相条件下，将生物素标记的第二抗体(羊抗抗dna抗体)、带有荧光物质的感光微球、以及包被有过度金属螯合物并偶联有第一抗体(四种序列特异性抗dna抗体)的发光微球，与检测样本混合。此时，包被有活性分子的发光微球可通过生物素标记的第二抗体快速识别检测样本中的目标分子，并与感光微球一起形成免疫夹心复合物。在激光(例如波长680nm)照射下，感光微球上的荧光物质将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，该单体氧随后扩散至发光微球，与其上的化学发光剂(如过度金属螯合物)反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团,使之发出荧光,波长为520-620nm。
9、由于单体氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离约为200nm。如果待测溶液中不存在目标分子，则不会发生上述分子间的相互作用，发光微球和感光微球分散在溶液中，二者之间的距离较远，单体氧无法扩散至作为受体的发光微球上，则不会产生荧光信号。反之，则会产生荧光信号，通过荧光信号的变化来进行rh血型的判断。
10、需要说明的是：本技术中的第一抗体是针对rhc/c变异位点c.307t>c和rhe/e变异位点c.676c>g的序列特异性抗dna抗体，即只要满足该抗体是能够特异性识别rhc/c变异位点c.307t>c和rhe/e变异位点c.676c>g，均能够满足本技术的要求。采用这种抗体，可特异性识别待测样本中的突变dna，从而实现高灵敏度检测。
11、进一步地，上述发光微球的制备方法包括：
12、将苯乙烯单体、聚乙烯吡咯烷酮加入醇溶液中，再加入二甲基α-氯甲基噻吩、二甲基咪唑、二氧化丁二烯-过度金属螯合物和丙烯酸，最后加入过氧化二月桂酰，分散均匀后置于n2氛围、60-70℃下进行聚合反应16-30h，反应完毕后将所得的聚合物微球进行洗涤，即得到发光微球。
13、其中，二氧化丁二烯-过度金属螯合物是通过下述方法制备的：将稀土金属化合物与二氧化丁二烯混合，并加入醇溶液，在n2保护下搅拌回流反应，得到。
14、在该聚合反应中，苯乙烯单体为基础物料，聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂，以醇溶液为溶剂(优选为15-30％的乙醇水溶液)，同时以二甲基α-氯甲基噻吩作为配合物，以二甲基咪唑和二氧化丁二烯作为固化剂，过氧化二月桂酰为引发剂，以过渡金属作为发光物质，通过溶剂挥发法进行聚合。该聚合过程是通过自由基聚合反应进行的。自由基聚合是一种通过自由基参与的聚合反应，其中自由基是带有未成对电子的分子或原子。在聚苯乙烯的聚合中，主要涉及苯乙烯单体的自由基聚合反应。
15、聚苯乙烯的聚合过程可以简单地描述为以下几个步骤：
16、(1)引发剂的作用：在聚苯乙烯聚合反应中，引发剂能够产生自由基，并在聚合反应的初期阶段引发聚合反应的发生。(2)引发聚合反应：引发剂产生自由基后，自由基会与苯乙烯单体分子发生反应，形成一个稳定的中间产物。这个中间产物可以进一步与其他苯乙烯单体或中间产物发生反应，从而不断延伸聚合链。(3)形成聚合物：随着聚合链的不断延伸和交联，最终形成大量的聚苯乙烯高分子化合物。
17、进一步地，上述二甲基α-氯甲基噻吩、二甲基咪唑、二氧化丁二烯-过渡金属螯合物的质量比为1:(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
18、更为优选地，上述二甲基α-氯甲基噻吩、二甲基咪唑、二氧化丁二烯-过渡金属螯合物的质量比为1:(0.9-1.1)：(0.9-1.1)。
19、进一步地，上述苯乙烯单体和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为4-6:1。
20、更为优选地，上述苯乙烯单体和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为5:1。
21、当上述物质之间的投料量满足上述比例关系时，所制得的发光微球具有本底信号值低、高灵敏性、高特异性、高稳定性的优势。
22、进一步地，上述二氧化丁二烯-过度金属螯合物中的过渡金属螯合物为铒螯合物、钆螯合物和铕螯合物中的任一种。
23、当发光物质为铒、钆或铕时，能够与感光微球上的荧光物质发生光激化学发光。较为优选地，发光物质为铒，其发光效果优于钆和铕，更有助于提高检测的灵敏性。
24、进一步地，上述第一抗体偶联的发光微球通过下述方法制得：
25、(1)将发光微球用碳二亚胺和sulfo-nhs活化，得到活化后的发光微球；
26、(2)将第一抗体的单克隆抗体与活化后的发光微球混合，并加入碳二亚胺，将混合体系于20-35℃下震荡0.5-1.5h后，离心洗涤，重悬于含有表面活性剂和防腐剂的缓冲液中。
27、进一步地，上述发光微球与第一抗体的质量比为50-100:1，优选地质量比为60-80:1。
28、进一步地，上述生物素标记的第二抗体通过下述方法制得：
29、将羊抗抗dna抗体与生物素溶液混合，20-35℃下震荡孵育1.5-2.5h；
30、羊抗抗dna抗体与生物素的质量比为50-100:1，优选地，质量比为60-80:1
31、进一步地，上述分析缓冲液包括hes、tris-hcl和bsa，分析缓冲液的ph为7.2-7.5。
32、第二方面，本技术提供一种上述rh血型基因检测试剂盒的制备方法，其包括：
33、(1)通过溶剂挥发法制备带有过度金属螯合物的发光微球，活化发光微球，再将四种分别针对rhc/c变异位点c.307t>c和rhe/e变异位点c.676c>g的序列特异性抗dna抗体与发光微球混合震荡孵育，得到第一抗体偶联的发光微球；
34、(2)再将羊抗抗dna抗体与生物素溶液混合，震荡孵育，得到生物素标记的第二抗体；
35、(3)最后再采用链酶亲和素修饰的荧光微球作为感光微球，并配制分析缓冲液。
36、综上所述，本技术至少具有以下有益效果：
37、1.本技术采用光激化学发光技术，利用感光微球和发光微球之间的单线态氧的传递作用来实现两种微球结合即发光，使得检测的特异性和灵敏度得到提升。
38、2.本技术通过设计引物序列特异性抗体分别针对rhc/c的变异位点c.307t>c和rhe/e的变异位点c.676c>g，进行靶基因检测，具有检测周期短、灵敏性高的特点。
39、3.在本技术的方法中，发光微球中的发光材料是在微球聚合过程中加入的，发光材料包裹在发光微球的颗粒中，从而在检测中不易受环境因素的干扰，有着更高的特异性和稳定性。
40、4.本技术采用活化后的羧基化发光微球和单克隆抗体(第一抗体)进行偶联,反应时间比醛基化发光微球偶联时间短且反应效率高,有利于提高试剂的检测灵敏度。