本发明提供一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法，属于食品安全检测。
背景技术：
1、链霉素（str）是一种对革兰氏阴性细菌具有特别的抑制作用的氨基糖苷类抗生素。然而，当其作为兽药使用不规范时，将会导致残留于肉类、牛奶和蜂蜜等食品中，对人体造成过敏反应、听力丧失和肾脏毒性等危害。因此，建立高效简便、灵敏准确的str残留检测方法至关重要。目前，高效液相色谱、微生物检测、酶联免疫等检测方法已用于检测牛奶中str的残留，但这些方法由于设备昂贵、技术水平要求高、检测时间长和操作繁琐等弊端限制了它们的应用。
技术实现思路
1、发明的目的在于需求一种高效灵敏、实惠简便的技术手段检测牛奶中的str。
2、其技术方案为：适配体是一小段通过经过体外筛选获得的对目标物质具有高亲和力的寡核苷酸序列。适配体因其合成容易、热稳定性高、靶标范围广等优势，为解决当前食品安全及环境监测等问题提供新的高效快速的识别元件。
3、所述的一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法（图1），针对str特异性适配体apt52的酶切位点处进行定点突变，基于纳米金（aunps）比色法制作apt52与各突变适配体对str的结合饱和曲线，根据解离常数（ kd）选择与str亲和力最强的突变适配体设计酶促反应的发卡结构，结合vent®(exo-) dna聚合酶和nt.alwi切刻内切酶辅助信号放大实现靶标循环和目的序列的置换。
4、所述的一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法（图2），利用ssdna1、ssdna2和aunps制备捕获探针，利用ssdna3和aunps制备扩增探针，通过捕获探针识别剪切-聚合酶促反应产生的目的序列，同时捕获扩增探针形成多重aunps探针放大信号。试纸条的硝酸纤维素膜处涂覆检测线（t线）和控制线（c线），t线通过与目的序列游离端杂交以捕获多重aunps探针，c线用于捕获过量的扩增探针。综上所述，我们建立了一种检测str的侧向适配体层析方法。
5、®(exo-) dna聚合酶的作用下延伸产生双链取代str，被取代的str与其他发卡结构结合开始新的循环。同时，nt.alwi切刻内切酶的特定识别位点在双链中生成，切刻内切酶在识别位点处产生缺口并开始新一轮复制。在聚合过程中通过链位移释放出短ssdna片段，释放出的目的序列末端通过与ssdna1碱基互补配对连接到捕获探针上，将形成的复合物滴至样品垫。当迁移至共轭垫时，扩增探针与捕获探针中的ssdna2连接形成多重aunps复合探针。复合探针中目的序列的自由端被t-ssdna捕获，在t线处形成红色条带；过量扩增探针被c-ssdna捕获，在c线处也形成红色条带。基于t、c线的灰度值比值定量检测str残留。
6、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：取100 μl的aunps溶液与20 μl五条适配体（750 nm）避光室温混合孵育30 min，接着将不同浓度梯度（0、1、2、5、10、25、50、100、200 nm）的靶标溶液加入到上述混合物中，随后立即加入20 μl 0.3 m的nacl溶液继续避光室温混合孵育30 min。通过多功能酶标仪分别测定溶液450~700 nm范围内的紫外可见吸收光谱，记录520 nm和675 nm处的吸光度（absorbance，a）。以str标准品浓度为横坐标，675nm和520 nm处的吸光度比值（a675/a520）为纵坐标，分别非线性拟合五条适配体的结合饱和曲线，得到每条适配体对应的 kd值，选择亲和力最佳的适配体apt52-0设计发卡结构。
7、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：利用1×te缓冲液溶解发卡结构后进行热变性。等温循环扩增反应体系包括：2 μl 500 nm发卡结构、2 μl 500 nm引物、10 μl 1×thermopol®反应缓冲液、5u vent®(exo-) dna聚合酶、5 μl 1 mm dntps、5.6 μl 1×cutsmart缓冲液和5u nt.alwi切刻内切酶。接着向体系中加入2 μl的str标准品（50 nm）触发等温循环扩增反应，反应在37°c下进行120 min。最后，将得到的混合物在80°c下加热10min，使酶失活以终止反应。利用链霉亲和素-磁性纳米颗粒与等温循环扩增反应产物混合，37°c下孵育1 h后磁分离去除沉淀，保留上清液。
8、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：采用5 mg/ml的tcep与8 µl ssdna1和ssdna2混合以激活硫醇基团。向活化后的dna溶液中加入1 ml aunps，在50°c下反应22 h以合成捕获探针。反应结束后加入100 µl 0.1 m磷酸盐缓冲液a（含0.1%（m/v）sds，ph 7.6）孵育1 h。然后分次加入0.01 m磷酸盐缓冲液b（含0.01%（m/v）sds和1 m nacl）直至nacl浓度达到0.06 m，将混合物离心去除上清液。用超纯水洗涤后再次离心保留沉淀，以去除未与aunps结合的ssdna1和ssdna2。将沉淀重悬在0.05 m磷酸盐缓冲液c（含0.05%（m/v）sds，ph7.6）中。制备好的捕获探针4°c避光保存备用。以相同的方法处理8 µl ssdna3以合成扩增探针。
9、所述适配体试纸条的制备工艺如下：预处理前，牛奶样品分别添加100 nm、200 nm和400 nm的str。然后，用以下方法对样品进行预处理。首先，将3份4 ml添加靶标的牛奶样品分别加入16 ml甲醇，在-20℃冷冻20 min后12000 rpm下离心15 min以去除沉淀。上清液通过0.22 μm的滤膜，滤液在60°c下干燥，剩余的溶液用氮气干燥。用超纯水悬浮后再次通过0.22 μm的滤膜，将所得溶液的体积设置为4 ml。
10、本申请相对于现有技术，获得的有益效果如下：
11、1、通过使用纳米复合探针，本发明可以显著增强试纸条的信号强度，满足微量准确检测，对于需要高灵敏度的应用场景具有重要意义。
12、2、相较于传统的化学试剂放大方法，本发明的操作流程更加简便，具有广泛的适用性，不需要复杂的试剂混合或特殊的操作步骤，降低了对操作人员技术水平的要求，使得检测过程更加快速高效。
13、3、传统的信号放大技术可能涉及有毒有害试剂，而本发明使用的材料和方法更加环保，对环境和人体健康更为友好，符合现代绿色化学的理念。
1.一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法，其特征在于：定点突变优化获得的链霉素特异性适配体apt52-0，设计包含apt52-0的发卡结构用于酶促反应，开发了一种基于酶辅助和多重纳米金复合探针的二次信号放大的侧向层析纸基适配体试纸条，用于检测链霉素。
2.如权利要求1所述的一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法，其特征在于：定点突变str特异性适配体apt52保护酶切位点，根据纳米金比色法选择亲和力最佳的适配体apt52-0。
3.如权利要求1所述的一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法，其特征在于：设计包含apt52-0的发卡结构，结合vent®exo- dna聚合酶和nt.alwi切刻内切酶辅助进行信号放大，实现靶标和目的序列的置换。
4.如权利要求1所述的一种检测链霉素残留的侧向层析适配体试纸条的制备方法，其特征在于：通过捕获探针和扩增探针杂交形成多重纳米金探针，聚集纳米金实现目的序列捕获和信号放大，读取并分析t、c线的红色条带灰度比值定量检测str。