本发明属于药物分析，具体涉及一种甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的分离、测定方法。
背景技术：
1、甲磺酸芦可替尼是一种治疗骨髓纤维化、真性红细胞增多症和皮质类固醇难治性急性移植物抗宿主病的有效药物。它通过选择性抑制jak1和jak2蛋白激酶的活性，干扰了依赖于jak-stat信号传导的炎症反应和细胞增殖，从而有效改善相关疾病的症状。
2、甲磺酸芦可替尼中间体z2是芦可替尼的d-dmta(拆分剂)盐，其结构式如式1所示。
3、
4、研究发现，甲磺酸芦可替尼中间体z2中可能含有如下多种杂质：三聚硫氰酸、三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d、杂质z1、杂质z1a、杂质z1b、杂质z1d、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质sm1b、三苯基膦。其中，杂质sm1b为基毒杂质。为保障甲磺酸芦可替尼原料药及制剂产品的质量，需要对甲磺酸芦可替尼中间体z2进行质量控制。然而目前缺乏能够分离测定甲磺酸芦可替尼中间体z2中相关杂质的现有技术。
5、部分现有技术对芦可替尼相关物质的分离测定方法进行报道，但无法实现甲磺酸芦可替尼中间体z2及其上述相关杂质的分离检测。例如，cn117517528a专利公开了一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，其采用高效液相色谱法进行检测；色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：流动相a为ph＝2.0-4.0的磷酸二氢盐溶液，流动相b为乙腈；采用梯度洗脱；紫外检测，检测波长为222nm。该方法能够同时检测出4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1h-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1h-吡唑-4-基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯、三苯基氧化膦。
6、因此，有必要建立一种简便、高效、灵敏的方法，用于甲磺酸芦可替尼中间体z2中相关杂质的分离测定。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于高效液相色谱法分离甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的分离。
2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：
3、基于高效液相色谱法分离甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的方法，所述甲磺酸芦可替尼中间体z2和所述杂质共同组成组合物，所述杂质包括三聚硫氰酸、三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d、杂质z1、杂质z1a、杂质z1b、杂质z1d、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质sm1b和三苯基膦中的任一种或多种；所述甲磺酸芦可替尼中间体z2溶解后生成芦可替尼和d-dmta；上述化合物的结构式如下：
4、
5、
6、所述高效液相色谱法中，固定相：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；流动相：以磷酸盐缓冲液为流动相a，以甲醇和乙腈的混合溶液为流动相b，进行线性梯度洗脱。
7、分离检测后用于下一步生产。
8、上述杂质可以按照多种方式排列组合。例如，组合方式1：三聚硫氰酸、三苯基氧膦。又如，组合方式2：三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d。再如，组合方式3：杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d。
9、在此不穷举所有排列组合方式。理论上，本方法的分离、鉴定和/或含量检测的物质上限为n(为数量)种时，自然可以检测1-n种物质。
10、进一步，所述线性梯度洗脱的程序如下：
11、 时间-分钟 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 70±10 30±10 4±1 70±10 30±10 32±1 20±10 80±10 41±1 20±10 80±10 42±1 70±10 30±10 50±1 70±10 30±10
12、。
13、作为优选，所述线性梯度洗脱的程序如下：
14、 时间-分钟 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 70±2 30±2 4 70±2 30±2 32 20 80 41 20 80 42 70±2 30±2 50 70±2 30±2
15、。
16、例如，在0分钟、4分钟、42分钟和/或50分钟时，流动相a占68份、流动相b占32份(图21)；或流动相a占69份、流动相b占31份；或流动相a占70份、流动相b占30份(图3)；或流动相a占71份、流动相b占29份；或流动相a占72份、流动相b占28份(图20)。
17、作为最优选，所述线性梯度洗脱的程序如下：
18、 时间-分钟 流动相a-体积份 流动相b-体积份 0 70 30 4 70 30 32 20 80 41 20 80 42 70 30 50 70 30
19、。
20、进一步，所述流动相a为浓度为20-50mmol/l、ph为3-5的磷酸二氢钾溶液；所述流动相b中，甲醇和乙腈的体积比为40-60：60-40。
21、作为优选，所述流动相a为浓度为28-32mmol/l、ph为3.9-4.1的磷酸二氢钾溶液；所述流动相b中，甲醇和乙腈的体积比为50：50。
22、作为最优选，所述流动相a为浓度为30mmol/l、ph为4.0的磷酸二氢钾溶液。
23、作为优选，所述流动相a的ph调节剂为磷酸。
24、进一步，流速为0.7-1.3ml/min；柱温为30-40℃；进样器温度为3～10℃。
25、作为优选的方案，流速为0.9-1.1ml/min；柱温为33-37℃。例如，流速为0.9ml/min(图12)；或流速为1.0ml/min(图3)；或流速为1.1ml/min(图13)。又如，柱温为33℃(图14)；或柱温为34℃；或柱温为35℃(图3)；或柱温为36℃；或柱温为37℃(图15)。
26、作为最优选，流速为1.0ml/min；柱温为35℃。
27、作为优选，进样器温度为5℃。
28、作为优选，进样体积10μl。
29、作为优选，运行时间为50分钟。
30、作为优选，色谱柱规格为4.6mm×150mm，3μm。
31、作为最优选，色谱柱选择gl inersil ods-3，4.6mm×150mm，3μm。
32、作为优选，色谱条件还包括：加流动相杂质捕集柱，所述杂质捕集柱的规格为4.6mm×50mm。
33、作为最优选，所述杂质捕集柱选择色谱先生ghost-sniper column，4.6mm×50mm。
34、进一步，分离前，以甲醇为稀释剂配制待测溶液。
35、作为优选，所述待测溶液包括样品溶液、对照溶液和/或系统适用性溶液。
36、作为优选，所述样品溶液的浓度为2.0mg/ml。
37、作为优选，所述对照溶液的浓度为3μg/ml。
38、作为优选的方案，样品溶液的配制：取本品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，作为样品溶液。
39、作为优选的方案，对照溶液的配制：精密量取样品溶液适量，用稀释剂定量稀释制成每1ml中约含3μg的溶液，作为对照溶液。
40、作为优选的方案，系统适用性溶液的配制：取甲磺酸芦可替尼中间体z2系统适用性对照品(含甲磺酸芦可替尼中间体z2、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质z1、杂质sm2d、三聚硫氰酸)适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，作为系统适用性溶液。
41、本发明的目的之二在于提供一种鉴别甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的鉴定。
42、为实现上述目的，本发明的技术方案为：
43、鉴别甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的方法，采用前述分离方法分离所述组合物，并进入检测器进行检测，得到色谱图；通过比较检测品与对照品的色谱图谱特征，来确定检测品中是否含有甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质。
44、作为优选的方案，所述检测器的检测波长为220±10nm。±10nm的设定范围是基于误差考虑、方法优越性和实际应用需求等多方面因素的综合考虑。这一设定范围有助于确保检测结果的可靠性、提高测量的重复性和灵活性，并满足特定实验的要求。
45、作为最优选，作为优选所述检测器的检测波长为220nm。
46、作为优选的方案，按照相对保留时间的先后顺序，可以鉴定出组合物中的各组份，所述组合物的组份按照升序依次为：杂质c、杂质sm2d、三聚硫氰酸、d-dmta、杂质sm1d、杂质d、杂质f、杂质z1b、芦可替尼、杂质z1a、杂质b、杂质sm1b、三苯基氧膦、杂质sm2、杂质sm1、杂质z1、杂质z1d、三苯基膦。
47、通常情况下，相对保留时间是用于描述混合物中不同组分在色谱柱上的相对保留程度，它是指某一组分的保留时间与参考组分(通常是主峰或已知组分)的保留时间的比值。这个比值反映了不同组分在色谱柱上的相对保留性能，是色谱分析中用于定位、定性和定量分析的重要参数。相对保留时间的计算方法是将目标组分的保留时间(tr)除以参考组分的保留时间(tr0)。
48、作为优选的方案，以甲磺酸芦可替尼中间体z2中主成分芦可替尼为参照峰，相对保留时间为0.15，判定为杂质c；相对保留时间为0.19，判定为杂质sm2d；相对保留时间为0.20，判定为三聚硫氰酸；相对保留时间为0.39，判定为d-dmta；相对保留时间为0.56，判定为杂质sm1d；相对保留时间为0.77，判定为杂质d；相对保留时间为0.89，判定为杂质f；相对保留时间为0.96，判定为杂质z1b；相对保留时间为1.00，判定为芦可替尼；相对保留时间为1.13，判定为杂质z1a；相对保留时间为1.17，判定为杂质b；相对保留时间为1.21和/或1.25，判定为杂质sm1b；相对保留时间为1.29，判定为三苯基氧膦；相对保留时间为1.54，判定为杂质sm2；相对保留时间为1.56，判定为杂质sm1；相对保留时间为1.76，判定为杂质z1；相对保留时间为1.81，判定为杂质z1d；相对保留时间为2.24，判定为三苯基膦；各组分的相对保留时间各自在±10％范围内浮动。
49、除了相对保留时间，也可以用保留时间来判定组组份。保留时间是指样品从进入色谱柱到被检测器检测到所需的时间。这个时间是根据组分在色谱柱上的移动速度计算的，即从进样开始到某个组分的色谱顶点(浓度极大值)的时间间隔。主要用于确定样品中各组分的出峰顺序和位置，是色谱分析中的基本数据之一。在质量控制中，保留时间的变化可以反映色谱柱的状态、流动相的稳定性以及仪器的性能等因素。
50、本发明的目的之三在于提供一种测定甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质含量的方法，该方法可以在较短的时间之内完成多种物质的鉴定及含量测定。
51、为实现上述目的，本发明的技术方案为：
52、测定甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质含量的方法，采用前述鉴别方法分离并鉴别甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质，得到色谱图；根据所得色谱图，采用限度法检测杂质sm1含量是否合格，和/或采用加校正因子的主成分自身对照法计算所述三聚硫氰酸、所述三苯基氧膦、所述杂质sm1d、所述杂质sm2、所述杂质sm2d、所述杂质z1、所述杂质z1a、所述杂质z1b、所述杂质z1d、所述杂质b、所述杂质c、所述杂质d、所述杂质f中的任一种或多种杂质的含量。
53、通过含量测定，我们进一步可以用于判定甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质含量是否合格。若三聚硫氰酸、三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d、杂质z1、杂质z1a、杂质z1b、杂质z1d、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f中的任一种或多种杂质峰面积大于对照溶液中对应杂质的峰面积，表明杂质含量不合格；反之，若三聚硫氰酸、三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d、杂质z1、杂质z1a、杂质z1b、杂质z1d、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f中的任一种或多种杂质峰面积不大于对照溶液中对应杂质的峰面积，表明杂质含量合格。
54、上述判定方式可以作为药品质量判定模型，进一步作为智能化生产流程中不可或缺的一个关键模块。该模型通过精确控制流动相组成、流速、柱温等参数，实现对药品中活性成分、杂质及降解产物的精准分离与定量分析，为药品质量的全面评估提供了科学依据。在智能化生产体系中，这一模型被无缝集成，能够实时接收来自生产线的原始数据，自动执行分析任务，并基于预设的质量标准迅速反馈判定结果。
55、本发明的有益效果在于：
56、本发明建立了一种分离测定甲磺酸芦可替尼中间体z2及其杂质的高效液相色谱法，该方法可在50分钟内实现甲磺酸芦可替尼中间体z2中多个杂质的有效分离，杂质包括三聚硫氰酸、三苯基氧膦、杂质sm1、杂质sm1d、杂质sm2、杂质sm2d、杂质z1、杂质z1a、杂质z1b、杂质z1d、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质sm1b和三苯基膦中的任一种或多种。方法验证实验结果表明，该方法专属性强，分离度好，灵敏度高，耐用性好，实用性强，检测结果准确可靠，对于实现甲磺酸芦可替尼中间体z2及甲磺酸芦可替尼成品质量控制具有重要的意义。