一种欧盟污染物限量法规eu 2023/915中的35种吡咯里西啶生物碱分离分析方法，具体为一种生物样品中35种吡咯里西啶生物碱的分离分析方法。
背景技术：
1、吡咯里西啶生物碱(pas)是菊科(如senecio spp.)、紫草科(如heliotropiumspp.)和豆科(如crotalaria spp.)中几种植物产生的有毒植物次生代谢物。pa在植物中以游离碱或n-氧化物(no)的形式存在。有几组pa和pa-n-oxides存在异构体形式。其中许多pa已被证明具有毒性，可导致肝静脉闭塞症(vod)、肝硬化并最终导致死亡。欧洲食品安全局(efsa)经2011、2016、2017年三次风险评估给出的意见书中认为，pa是潜在的基因毒性致癌化合物，即使剂量很低，也会对人体健康产生长期影响。含pa的植物可作为污染物存在于各类以植物为基础的食品和饲料原料中，包括茶、草药产品、香料、食品补充剂、蜂蜜等。欧盟委员会(ec)和成员国(ms)希望通过规范某些食品(如凉茶、草药产品、食品补充剂和香料)中1,2不饱和pa的含量来保护消费者的健康。2020年12月，欧盟委员会发布了关于某些食品中吡咯里西啶生物碱最高含量的第2020/2040号法规(2022年7月1日生效)，该法规于现以纳入关于食品中某些污染物最高含量的欧盟委员会法规(eu)2023/915。
2、欧盟委员会于2023年4月发布了一项(eu)2023/915号法规，该法规规定了关于某些食品中含有21种吡咯里西啶生物碱(pa)和14种共流出pa的统一法规，规定pa 35种总浓度的最大限量。最大限量是指以下21种吡咯里西啶生物碱的最小总和：
3、—促黑激素(im)、石松碱胺(la)、促黑激素氮氧化合物(imn)、石松碱胺氮氧化合物(lan)、千里光宁碱(sc)、春千里光碱,(sv)、千里光宁碱氮氧化合物(scn)、春千里光碱氮氧化合物(svn)、千里光菲林(sp)、千里光菲林氮氧化合物(spn)、倒千里光碱(re)、倒千里光碱氮氧化合物(ren)、蓝蓟定(em)、蓝蓟定氮氧化合物(emn)、毛果天芥菜碱(lc)、毛果天芥菜碱氮氧化合物(lcn)、克氏千里光碱(sk)、欧天芥菜碱(eu),、欧天芥菜碱氮氧化合物(eun)、天芥菜碱(hn)、天芥菜碱氮氧化合物(hnn)。以及以下另外14种已知与上述21种吡咯里西啶生物碱中的一种或多种共流出的吡咯里西啶生物碱：—大尾摇碱(id)、刺陵德草碱(en)、凌德草碱(rn)(可能与石松碱胺(la)、促黑激素(im)共流出)、大尾摇碱氮氧化合物(idn)、刺陵德草碱氮氧化合物(enn)、凌德草碱氮氧化合物(rnn)(可能与石松碱胺氮氧化合物(lan)、促黑激素氮氧化合物(imn)共流出)、全缘千里光碱(ir)(可能与春千里光碱(sv)、千里光宁碱(sc)共流出)、全缘千里光碱氮氧化合物(irn)(可能与春千里光碱(氮氧化合物(svn)、千里光宁碱氮氧化合物(scn)共流出)、天芥菜平(hs)(可能与蓝蓟定(em)共流出)、天芥菜平氮氧化合物(hsn)(可能与蓝蓟定氮氧化合物(emn)共流出)、鹰爪千里光碱(st)(可能与千里光菲林(sp)共流出)、鹰爪千里光碱氮氧化合物(stn)(可能与千里光菲林氮氧化合物(spn)共流出)、光萼野百合碱(us)(可能与倒千里光碱(re)共流出)、光萼野百合碱氮氧化合物(usn)(可能与倒千里光碱氮氧化合物(ren)共流出)。
4、法规规定应建立分析方法可以分别识别和定量吡咯里西啶生物碱，并将其计入总含量中，35个化合物详细信息见表4。
5、pas的分析通常采用液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)，该方法可用于测定pas及其异构体的总和或单独测定异构体，具体取决于所采用的色谱法。实际上，没有一种方法能够在一次分析中将所有异构体进行色谱分离，因此会出现异构体(部分)共洗脱的情况。德国联邦风险评估研究所(bfr)和负责食品和饲料中真菌毒素和植物毒素分析的欧盟参比实验室(eurl-mp)发布了用于测定植物性食品和饲料材料以及蜂蜜中某些pa组的经验证方法。但是，bfr方法不包括法规中列出的所有pa，并且存在同分异构化合物的各种共流出物；而eurl-mp方法在反相spe净化之前采用了中和步骤，并执行双条件色谱分析(酸性和碱性)，在酸性条件下依次分析21种pa、14种pa，酸性条件下有3组同分异构体分不开分别为idn+rnn+enn、en+rn、ir+sv，碱性条件下依次分析21种pa和14种pa，碱性条件下有4组同分异构体无法分开分别为im+la+id、snn+svn、imn+lan、ren+usn，即使采用了双色谱条件结合的方法仍有一对同分异构体la+id无法分开。2023年欧盟发布了动物饲料中吡咯里西啶生物碱的测定-液相色谱-质谱质谱法en 17683-2023，该方法分析28个pa并不完全涵盖列表中所包含的所有pa，同时方法中有四组同分异构体im+la、imn+lan、sc+sv、svn+scn因无法分开只能采用加和定量，上述方法因未将所有化合物分开，会导致定量结果不准确。
6、本技术采用的策略a柱与b柱可以分开包含10组同分异构体(共计28个化合物)在内的35个化合物。
技术实现思路
1、本发明涉及一种欧盟限量法规eu 2023/915中的35种吡咯里西啶生物碱的分离分析方法，35种化合物中共有10组异构体，具体为，采用a柱分离28种吡咯里西啶生物碱(其中包含8组异构体21个化合物，非同分异构体7个化合物，采用b柱分离7种比咯吡咯里西啶生物碱涉及2组异构体，a、b两柱结合分离35种吡咯里西啶生物碱。
2、一种植物样品中35种吡咯里西啶生物碱的分离分析方法，分别采用a柱和b柱对生物样品进行分离分析，a、b两柱结合可对生物样品中的35种吡咯里西啶生物碱进行分离；a柱为waters beh c18柱，b柱为thermo acclaim c30柱；35种吡咯里西啶生物碱，分别为：蓝蓟定组(蓝蓟定em、天芥菜平hs)、促黑激素组(促黑激素im、石松碱胺la、大尾摇碱id、刺凌德草碱en、凌德草碱rn)、促黑激素氮氧化物组(促黑激素氮氧化物imn、大尾摇碱氮氧化物idn、石松碱胺氮氧化物lan、刺凌德草碱氮氧化物enn、凌德草碱氮氧化物rnn)、倒千里光碱组(倒千里光碱re、光萼野百合碱us)、倒千里光碱氮氧化物组(倒千里光碱氮氧化物ren、光萼野百合碱氮氧化物usn)、千里光宁碱组(千里光宁碱sc、春千里光碱sv、全缘千里光碱ir)、千里光宁碱氮氧化物组(千里光宁碱氮氧化物scn、春千里光碱氮氧化物svn、全缘千里光碱氮氧化物irn)、千里光菲林组(千里光菲林sp、鹰爪千里光碱st)、千里光菲林氮氧化物组(千里光菲林氮氧化物spn、鹰爪千里光碱氮氧化物stn)、蓝蓟定氮氧化物组(蓝蓟定emn氮氧化物、天芥菜平氮氧化物hsn)、毛果天芥菜碱(lc)、毛果天芥菜碱氮氧化物(lcn)、克氏千里光碱(sk)、欧天芥菜碱(eu)、欧天芥菜碱氮氧化物(eun)、天芥菜碱(hn)、天芥菜碱氮氧化物(hnn)。
3、采用a柱对生物样品进行分离分析，a柱为waters beh c18(2.1mm×150mm,1.7um)，水相流动相为甲酸铵水溶液浓度范围为3～6mm/l，其中甲酸的浓度为0.01～0.03％(v/v)，有机相流动相为甲醇乙腈溶液，甲醇与乙腈的体积比例为1～10％；洗脱时，洗脱液中有机相的流动相体积比例初始为4～5％，0至20min有机相比例由初始比例4～5％至14～15％，20至33min有机相比例由14～15％至34～35％，33至36min有机相比例由34～35％至90～95％，36～38min有机相比例保持不变，39～40min有机相回到初始比例。
4、采用b柱对生物样品进行分离分析，b柱为thermo acclaim c30(2.1mm×150mm,3.0um)，水相流动相为甲酸铵水溶液浓度范围为3～6mm/l，其中甲酸的浓度为0.1～0.5％(v/v)，有机相流动相为甲醇乙腈溶液，甲醇与乙腈的体积比例为30～50％；洗脱时，洗脱液中有机相的流动相体积比例初始为1～2％，0至12min有机相比例由初始比例1～2％至3～4％，13至18min有机相比例由3～4％至34～35％，19至20min有机相比例由34～34％至90～95％，21～23min有机相比例保持不变，23～25min有机相比例为回到初始比例。
5、采用a柱可分离28种吡咯里西啶生物碱，a柱分离涉及蓝蓟定组(蓝蓟定em、天芥菜平hs)、促黑激素氮氧化物组(促黑激素氮氧化物imn、大尾摇碱氮氧化物idn、石松碱胺氮氧化物lan、刺凌德草碱氮氧化物enn、凌德草碱氮氧化物rnn)、倒千里光碱组(倒千里光碱re、光萼野百合碱us)、千里光宁碱组(千里光宁碱sc、春千里光碱sv、全缘千里光碱ir)、千里光菲林组(千里光菲林sp、鹰爪千里光碱st)、千里光菲林氮氧化物组(千里光菲林氮氧化物spn、鹰爪千里光碱氮氧化物stn)、蓝蓟定氮氧化物组(蓝蓟定emn氮氧化物、天芥菜平氮氧化物hsn)、千里光宁碱氮氧化物组(千里光宁碱氮氧化物scn、春千里光碱氮氧化物svn、全缘千里光碱氮氧化物irn)共计9组23个化合物、非同分异构体7个化合物分别为毛果天芥菜碱(lc)、毛果天芥菜碱氮氧化物(lcn)、克氏千里光碱(sk)、欧天芥菜碱(eu)、欧天芥菜碱氮氧化物(eun)、天芥菜碱(hn)、天芥菜碱氮氧化物(hnn)，共计28个化合物；
6、和/或采用b柱分离7种比咯里西啶生物碱，b柱分离涉及促黑激素组(促黑激素im、石松碱胺la、大尾摇碱id、刺凌德草碱en、凌德草碱rn)、倒千里光碱氮氧化物组(倒千里光碱氮氧化物ren、光萼野百合碱氮氧化物usn)共计7个化合物。
7、a柱流动相及流动相waters acquity beh c18(2.1mm×150mm,1.7μm)；流动相a：4～5mm甲酸铵体积浓度0.013～0.015％甲酸水溶液，流动相b：meoh:acn＝95～97:5～3(v:v)溶液；梯度洗脱：0–0.01min,3～5％ b；0.01–20min,5～15％ b；20–34min,15～35％ b；34–35.0min,35～95％ b；35.0～37.0min,95％ b；37.0–38.0min,95％ b回到初始流动相比例3～5％ b；38.0～40.0min,保持比例不变；流速：0.3～0.4ml/min.进样体积5μl；柱温：40～45℃；
8、b柱流动相及流动相thermo acclaim c30(2.1mm×150mm,3.0um)；流动相a：4～5mm甲酸铵体积浓度0.13～0.15％甲酸水溶液，流动相b：meoh:acn＝40～45:60～55(v:v)溶液；梯度洗脱：0–0.01min,1～2％ b；0.01–12min,1～4％ b；12–18min,4～15％ b；18–20.0min,15～35％ b；20.0～20.1min,35～95％ b；20.1–23.0min,95％b；23.0～23.1min,回到初始流动相比例1～2％ b；23.1～25.5min,保持比例不变；流速：0.6～0.8ml/min；进样体积5μl；柱温：40～45℃。
9、所述植物样品为紫草科、菊科、豆科、唇形科等植物样品中的一种或二种以上。
10、所述植物样品的预处理方法为：
11、干燥的植物样品采用刀式研磨仪gm200研磨过孔径0.2mm-1mm筛，取通过筛的组份备用；
12、a、硫酸甲醇溶液
13、b、50mm硫酸溶液配制
14、c、小心移取2.665ml质量浓度98％的浓硫酸缓慢加入1000ml中,搅拌均匀，放置室温；
15、d、硫酸甲醇溶液配制
16、e、移取50mm硫酸溶液200ml加入甲醇溶液200ml，混匀备用；
17、f、2.5％氨水甲醇溶液配制：
18、g、移取2.5毫升质量浓度25-28％的氨水加入至100ml甲醇中，混匀备用；
19、h、5:95甲醇水溶液
20、i、移取5ml甲醇加入95ml水中，混匀备用。；
21、a、称取试样2.00g(精确至0.01g)于50ml离心管中，准确加入20ml提取液(50mm硫酸：甲醇(1:1,v/v)的混合溶液)，涡旋混合1min，超声提取10min，4℃10000r/min离心5min，收集上清液待mcx固相萃取净化；
22、b、移取上清液2ml加至waters mcx固相萃取柱(6cc 150mg，使用前依次用4ml甲醇、4ml水活化)上，依次用4ml水、4ml甲醇淋洗，4ml洗脱液2.5％氨水甲醇溶液(v/v)洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用0.5ml甲醇:水(体积比5:95)复溶，过0.22μm有机相滤膜，收集透膜液于进样瓶待测；
23、b、甲酸溶液提取
24、a、称取试样2.00g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入20ml萃取溶剂(体积浓度0.2％甲酸水)，用涡旋混合器混合1min，超声提取10min，4℃10000r/min离心5min。将2毫升上清液转移到15毫升的离心管中，并加入120μl中和溶剂(1m碳酸铵水溶液)，调整ph值7-8之间。将离心管以10000r/min离心5min，收集上清液待hlb固相萃取净化；
25、b、移取上清液2ml加至waters hlb固相萃取柱(6cc 150mg，使用前依次用6ml甲醇、6ml水活化)上，依次用6ml体积浓度1％甲酸水、6ml水淋洗，真空抽干，6ml甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用0.5ml甲醇:水(体积比5:95)复溶，过0.22μm有机相滤膜，收集透膜液于进样瓶待测。
26、本发明具有如下优点：
27、1、采用本发明的a柱和b柱结合的策略，可实现欧盟法规eu 2023/915中规定的35种吡咯里西啶生物碱的精准分离定性定量检测。
28、2、采用本发明的a柱和b柱结合的策略，促黑激素组(5个化合物)的分离明显优于欧盟官方实验室的方法，欧盟官方实验室的方法采用了酸碱流动相双柱的方法依然没有分离开促黑激素组的la+id，在本专利的b柱促黑激素组(5个化合物)上可实现分离见附图2，难分离的促黑激素氮氧化合物组(5个化合物)在a柱上可实现分离，欧盟官方实验室采用酸性条件下促黑激素氮氧化合物分析促黑激素氮氧化合物imn+lan，在碱洗条件下分离促黑激素氮氧化合物idn+rnn+enn，同时欧盟官方实验方法中酸性流动相分不开的ir+sv，碱洗条件下分不开的snn+svn、ren+usn同分异构体在本专利a柱上除ren+usn采用b柱，其余均可在a柱上分开。
29、3、采用本发明的a柱策略35种吡咯里西啶生物碱可在一次分析的条件下确定是否需要与b柱结合，当样品中不含促黑激素组和倒千里光碱氮氧化合物时，可采用a柱进行35种吡咯里西啶生物碱定量检测，当样品中含有促黑激素组和倒千里光碱需要采用b柱进行促黑激素组和倒千里光碱氮氧化合物组定量检测。我们的策略明显优于欧盟官方实验室的方法，欧盟官方实验的方法是样品必须进行一次酸性条件下测试，一次碱性条件下测试，才能确定样品中是否含有法规规定的35种生物碱，即使采用酸碱策略依然无法确定样品是否含有促黑激素组的la+id。