本发明属于药物制剂检测，具体涉及一种桑菊败毒饮的uplc指纹图谱检测方法。
背景技术：
1、桑菊败毒饮由桑叶、菊花、金银花、连翘、黄芩、前胡、柴胡等16味中药组成，以开达肺卫郁闭为主，肺胃同治，表里同治，用于治疗感冒、发热、咳嗽及肺部感染。近年来，中药制剂的整体质量评价越来越受到广泛关注。中药指纹图谱是目前广泛用于评价中药质量的分析方法，可以较好地控制中药质量。
2、如中国专利cn100573138a中公开了一种夏桑菊制剂指纹图谱的建立及指纹图谱，方法包括：(a)对照品溶液的制备；(b)供试品溶液的制备；(c)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为0.103％醋酸与甲醇组成的梯度洗脱液；柱温：25-50℃；紫外检测波长为285-295nm；流速为0.5-1.5ml/min；时间为30-80min；(d)测定：高效液相色谱法得指纹图谱。该发明能有效表征夏桑菊制剂的质量，有利于监控产品的质量；具有稳定性、精密性高、重现性好，可快速、准确鉴别产品的真伪优劣。
3、再如中国专利cn114609321a中公开了一种辣木叶桑叶植物饮料指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，该发明采用高效液相指纹图谱技术结合指纹图谱评价软件，通过对测定波长、流动相洗脱程序、流速、柱温、进样量进行筛选和优化，得出了分离度良好、基线平稳、无负吸收色谱峰，且成分种类丰富、含量高的样品制备方法和指纹图谱色谱条件，经过多批次产品指纹图谱相似度比较分析，得出各指纹图谱相似度均在0.97以上，表明该发明方法能够准确、稳定、可靠地将辣木叶桑叶植物饮料产品中各种成分信息反映在指纹图谱中，能够对产品的质量进行全面、客观、科学地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及有效性。
4、再如中国专利cn114252518a公开了一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，所述的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：桑白皮汤物质基准的制备；供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；利用高效液相色谱仪测定；桑白皮汤指纹图谱的构建。色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；检测波长为250nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl；甲醇和磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。该方法具有重复性好、稳定性和精密度高，操作简便等优点。采用该方法建立的桑白皮汤物质基准指纹图谱有23个共有峰，指认了4个共有特征峰，选择7号峰作为指纹图谱中的参照峰，对桑白皮汤物质基准进行了研究，为其后续研究开发奠定了基础。
5、但是现有技术中没有针对桑菊败毒饮的指纹图谱检测方法，本发明采用uplc法建立桑菊败毒饮指纹图谱分析的基础上结合特征成分的量值传递规律，以期为该方的质量评价标准提供参考，保证制剂的安全性和有效性。
技术实现思路
1、基于现有技术的不足，本发明旨在提供一种桑菊败毒饮的uplc指纹图谱检测方法，该方法通过对20批桑菊败毒饮进行检测共标定了33个共有峰，通过与对照品比对，指认出19个共有峰。并且具有检检测重复性、稳定性和加样回收率良好、色谱峰信息多的特点。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种桑菊败毒饮的uplc指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
4、(1)桑菊败毒饮基准样品溶液的制备：取桑菊败毒饮原料煎煮，浓缩，即得基准样品溶液；
5、(2)供试品溶液的制备：取桑菊败毒饮基准样品溶液，置于容量瓶中，加无水甲醇至刻度线以下，超声，冷却后用无水甲醇定容至刻度线，摇匀，离心，取上清液，微孔滤膜滤过，即得；
6、(3)对照品溶液的制备：分别精密称定新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、野黄芩苷、连翘酯苷a、异绿原酸b、异绿原酸a、1,5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、异绿原酸c、异甘草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、白花前胡甲素对照品，加入甲醇制成溶液，即得。
7、(4)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；
8、(5)指纹图谱的构建：将不同批次的供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到桑菊败毒饮的指纹图谱。
9、作为优选地方法，步骤(1)中所述的煎煮的次数为2次，第一次加12倍量水煎煮2小时，第二次加10倍量水煎煮1小时。
10、作为优选地方法，步骤(1)中所述的浓缩为浓缩至150ml。
11、作为优选地方案，步骤(1)中所述的桑菊败毒饮基准样品溶液的制备方法如下：取桑叶10g、菊花10g、金银花10g、连翘10g、荆芥10g、苏叶10g、羌活10g、炙麻黄10g、杏仁10g、生石膏30g、炙甘草6g、前胡10g、柴胡12g、炒黄芩12g、南沙参12g和熟大黄6g，煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮2小时，第二次加10倍量水煎煮1小时，合并2次滤液，浓缩至150ml，即得基准样品溶液。
12、作为优选地方案，步骤(2)中所述的供试品溶液的制备方法如下：取桑菊败毒饮基准样品溶液2ml，至5ml容量瓶中，加入无水甲醇至刻度线以下，超声(400w、40khz)30min，冷却后用无水甲醇定容至刻度线，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。
13、作为优选地方案，步骤(3)中所述的对照品溶液的制备方法如下：分别精密称定新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、野黄芩苷、连翘酯苷a、异绿原酸b、异绿原酸a、1,5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、异绿原酸c、异甘草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、白花前胡甲素对照品，分别加入甲醇制成浓度为240μg/ml、230μg/ml、224μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、205μg/ml、180μg/ml、205μg/ml、270μg/ml、220μg/ml、173.33μg/ml、170μg/ml、186μg/ml、345μg/ml、232μg/ml、120μg/ml、350μg/ml、70μg/ml、280μg/ml的对照品溶液，即得。
14、作为优选地方案，步骤(4)中所述的测定为分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液2μl，注入高效液相色谱仪，进行测定。
15、作为优选地方案，步骤(4)中所述的测定的色谱条件为：
16、色谱柱：capcell pak c18色谱柱(150mm×2.0mm，2μm)；
17、流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液；
18、梯度洗脱：0-15min，6％-10％乙腈；15-18min，10％-12％乙腈；18-48min，12％-14％乙腈；48-68min，14％-30％乙腈；68-85min，30％-95％乙腈；
19、体积流量：0.3ml/min；
20、柱温：35℃；
21、检测波长：350nm；
22、进样量：2μl。
23、作为优选地方案，步骤(5)构建指纹图谱后进行相似度评价，所述相似度评价方法为：将指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价分析，确定出33个共有峰，编号依次为1-33号峰。
24、其中，1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸；3号峰为咖啡酸，4号峰为隐绿原酸，5号峰为1,3-二咖啡酰奎宁酸；11号峰为木犀草苷；12号峰为野黄芩苷，14号峰为连翘酯苷a；15号峰为异绿原酸b，16号峰为异绿原酸a，18号峰为1,5-二咖啡酰奎宁酸；19号峰为芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷；20号峰为迷迭香酸；22号峰为异绿原酸c；25号峰为异甘草苷；26号峰为黄芩苷；27号峰为木樨草素；31号峰为汉黄芩苷；33号峰为白花前胡甲素。
25、使用前述方法测定20批桑菊败毒饮基准样品，得到15个批次的桑菊败毒饮图谱s1-s20，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版评价各批次桑菊败毒饮物质基准hplc图谱的相似度，相似度结果分别为0.935、0.977、0.998、0.997、0.996、0.983、0.966、0.979、0.991、0.987、0.983、0.983、0.986、0.974、0.945、0.954、0.985、0.980、0.994、0.993，相似度均大于0.93。表明20批桑菊败毒饮uplc基准样品整体相似性良好，所建立的指纹图谱稳定，可以反映物质基准的指纹特征。
26、相比现有技术，本发明的有益效果是：
27、(1)本发明建立了20个批次桑菊败毒饮的指纹图谱，相似度均大于等于0.93，可以更加全面的反应桑菊败毒饮所含有的成分信息，更好的表征桑菊败毒饮的质量。指纹图谱为了获得丰富的图谱信息，通常通过长时间检测以达到获得更多共有峰、以及提高共有峰的分离度，而本发明获得33个共有峰，且用时仅为85分钟，且各峰之间分离度好。
28、(2)本发明标定了33个共有峰，指认了19个共有特征峰，其中，1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸；3号峰为咖啡酸，4号峰为隐绿原酸，5号峰为1,3-二咖啡酰奎宁酸；11号峰为木犀草苷；12号峰为野黄芩苷，14号峰为连翘酯苷a；15号峰为异绿原酸b，16号峰为异绿原酸a，18号峰为1,5-二咖啡酰奎宁酸；19号峰为芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷；20号峰为迷迭香酸；22号峰为异绿原酸c；25号峰为异甘草苷；26号峰为黄芩苷；27号峰为木樨草素；31号峰为汉黄芩苷；33号峰为白花前胡甲素。本发明提供的检测方法得到的指纹图谱中保留时间适中，与前后色谱峰之间分离度均大于1.5，精确度高、重复性好，能够准确反映指纹图谱所包含的成分信息，能够有效保证产品质量的稳定性和有效性。
29、(3)桑菊败毒饮主要由桑叶、菊花、金银花、连翘、黄芩、前胡、柴胡等16味原料和其他辅料经过复杂工艺制成，化学成分较为复杂，单一成分的含量测定往往带有片面性，不能反映产品的整体成分信息。本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对桑菊败毒饮全方的质量控制，不是对单一化合物或药材进行鉴别，能更加有效地指导投料，严格规范生产操作，确保临床用药安全、有效。
30、(4)将本发明中建立的指纹图谱方法用于桑菊败毒饮物质基准的质量监控，能从整体上、全面有效地对桑菊败毒饮的质量进行控制，从而保证产品的稳定性、可靠性与安全性。