本技术属于生物检测，具体涉及一种色氨酸结合型胆酸的检测方法，更具体涉副干酪乳酪杆菌lc19降血糖活性成分trpca的检测方法。
背景技术：
1、色氨酸结合型胆酸（tryptophan-cholic acid，trpca或trp-ca）是近年来新发现的菌源产生的氨基酸结合型胆酸。研究表明，trpca可激活孤儿受体mrgpre，促进肠道glp-1以及胰岛素的分泌，改善葡萄糖耐受，发挥减重和降血糖的作用。开发一种操作简便、灵敏度高、经济实用易推广的trpca检测方法对筛选出能够合成这种有益代谢物的特定菌株、优化益生菌生产工艺、评估益生菌trpca转化率、监控发酵液质量、研究疾病机制与发现生物标志物、评估肠道健康与菌群功能等方面均能发挥重要作用。
2、因此，开发一种简单易操作的trpca检测方法十分必要。
技术实现思路
1、本技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本技术提供了一种色氨酸结合型胆酸的检测方法，该方法具有灵敏度高、准确性高、重复性好等优点。
2、本技术是基于发明人的下列发现而完成的：
3、目前，现有trpca检测方法均为液相色谱串联质谱法（lc-ms），但由于其仪器成本昂贵、操作流程复杂，并且通常依赖内标物进行准确定量，导致该方法在实际推广应用中受到较大限制，检测成本较高。
4、基于trpca内源性荧光发色团——吲哚环（图1）的特性，本技术的发明人开发了一种高效液相色谱-荧光检测法（hplc-fld）检测trpca。该方法通过利用trpca的分子结构中内在荧光发色团，可直接被荧光检测器高灵敏度地捕获，实现对trpca的高灵敏度、高选择性直接检测。该方法填补了hplc-fld在trpca检测领域的空白，在特异性、检出限、定量限、正确度和重复性方面都经过验证，具有良好的方法学性能，可实现了trpca的操作简便、高灵敏度、高选择性、高准确度、成本经济的检测，可为发酵液、生物样本等多种基质中trpca的准确定量及相关生物学研究提供关键技术支撑。
5、在本技术的一个方面，本技术提出了一种色氨酸结合型胆酸的检测方法。根据本技术的实施例，所述方法包括：
6、s1、采用甲醇水溶液对待检样本进行预处理，得到检测溶液；
7、s2、将检测溶液进行高效液相色谱-荧光检测仪分析，确定所述色氨酸结合型胆酸的含量；
8、其中，所述高效液相色谱-荧光检测仪中的梯度混合器和进样器间增加杂质捕集小柱；
9、所述高效液相色谱-荧光检测仪的色谱条件包括：
10、流动相：流动相a选自甲醇，流动相b选自乙酸铵溶液；
11、梯度洗脱条件：
12、起始比例为流动相a为40%、流动相b为60%，维持至4.0 min；4.0~24.0 min内，流动相a上升至80%、流动相b下调至20%，维持至26.0 min；26.1 min，流动相a上升至90%、流动相b下调至10%，维持至28.0 min；28.0~30.0 min内，变为流动相a下调至40%、流动相b上升至60%，维持至38.0 min；
13、所述高效液相色谱-荧光检测仪的荧光检测条件为：激发波长为280 nm，发射波长为320~380 nm。
14、本技术的方法通过吲哚环的特征荧光以及通过优化检测步骤和色谱条件，实现准确检测钠摩尔每升级别的trpca，本技术的方法具备与lc-ms法相当的trpca检测能力，解决了lc-ms法仪器成本昂贵、操作流程复杂、检测成本较高的应用局限，为相关分析需求提供了一种高效、经济的可靠方案。由此，本技术的方法具有高灵敏度、高准确性、高选择性，且操作简便、成本经济、适用性广。
15、在本技术的一个可选实施例中，所述杂质捕集小柱的内径为4.6 mm，柱长为50mm，耐压为40 mpa。
16、在本技术的一个可选实施例中，所述杂质捕集小柱选自ghost-buster column杂质捕集小柱。
17、在本技术的一个可选实施例中，所述色谱条件中的增益pmt为8~10。
18、在本技术的一个可选实施例中，所述流动相b选自浓度为5~20 mmol/l、ph值为3.0~5.0的乙酸铵溶液。
19、在本技术的一个可选实施例中，所述色谱条件中采用的色谱柱为c18色谱柱，流速0.3~0.6 ml/min，柱温30~45℃，进样体积20~50 μl。
20、在本技术的一个可选实施例中，所述c18色谱柱的柱长150 mm，内径3.0 mm，表面多孔填料，填料粒径2.7 μm。
21、在本技术的一个可选实施例中，所述c18色谱柱选自agilent，infinitylabporoshell 120 ec-c18。
22、在本技术的一个可选实施例中，步骤s1中，所述预处理包括：
23、s1-1、将待测样本与甲醇水溶液进行混合处理，所述待测样本为液态、所述待测样本与甲醇水溶液的体积比为1：（1~3），或者所述待测样本为固态、所述待测样本与甲醇水溶液的体积比为1：（8~12）；
24、s1-2、将混合处理产物进行离心处理，取上清液，以便得到所述检测溶液。
25、在本技术的一个可选实施例中，所述甲醇水溶液选自40~60%的甲醇水溶液。
26、在本技术的一个可选实施例中，所述待测样本为液态，所述混合处理选自漩涡振荡。
27、在本技术的一个可选实施例中，所述待测样本为固态，所述混合处理选自超声处理。
28、在本技术的一个可选实施例中，所述离心处理的转速为10000~15000 rpm，温度为4℃，时间为5~15 min。
29、在本技术的一个可选实施例中，所述漩涡振荡的时间为5~15 min。
30、在本技术的一个可选实施例中，所述超声处理的时间为30~60 min。
31、在本技术的一个可选实施例中，步骤s1中，所述预处理进一步包括：
32、s1-3、将步骤s1-2中的所述上清液进行氮吹浓缩处理。
33、在本技术的一个可选实施例中，所述氮吹浓缩的温度为30~40℃。
34、有益效果：
35、1、本技术的方法利用trpca自身分子结构上吲哚环的特征荧光，首次提供了一种使用高效液相色谱分离，荧光检测的trpca检测方法，这种方法直接、高效地利用了目标物分析物自身的理化特性，且不受色氨酸（分子结构上同样有吲哚环）等杂质和无荧光杂质的干扰。该方法填补了hplc-fld技术检测trpca的空白。并且该方法在特异性、检出限、定量限、正确度和重复性方面都经过验证，具有良好的方法学性能，方法实现了trpca的操作简便、高灵敏度、高选择性、高准确度、成本经济的检测。
36、2、本技术的方法操作简便、成本经济、实用性高、适用性广，兼具高灵敏度。尤其是相较于已报道的lc-ms法，本技术的方法具备显著的综合优势，具体表现为：1）仪器操作更为便捷，对操作人员要求较低；2）所产生的数据量更少，数据分析负担降低；3）hplc-fld仪器的购置与维护成本远低于lc-ms，且该仪器在常规分析实验室中普及度更高，极大地提升了本方法的实用性与可推广性；4）该方法的定量限低至2 nmol/l，能够有效覆盖现有技术（专利号cn119215078a、cn119235873a）中益生菌合成trpca的含量范围（3.9~140.43 nmol/l）。
37、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。