专利名称:用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理方法
技术领域：
本发明涉及一种超薄切片表面处理方法，具体是一种用于原子力显微镜纳米 定位的超薄切片表面处理方法，属于生物工程技术领域：
。
技术背景
超薄切片术是供透射电子显微镜观察的样品制备技术，但近年超薄切片(厚 度一般在50 70 nm)也常用于原子力显微镜(AFM)观察进行表面结构分析和 形态研究。如1993年Amako等比较分别利用玻璃刀和钻石刀切得的包埋有细菌 样品的片子，发现后者表面更平整一些，但也只能大致显示细菌的轮廓，AFM图 像的分辨率不够高，尚无法进行细胞内部结构的分辨。后来1994年Ushiki等在 这方面作了努力，发展了去包埋剂的方法，使得成像质量有所提高。1998年0sada 等则采用了一种电子蚀刻的方法来"减薄"切片，即用高速电子轰击以去除一部 分包埋介质，暴露细胞表面形态结构，再用AFM就能够观察到更多的超微结构。 上述这些方法都只能用于表面结构的分辨和形态分析，图像反差不够理想，不能 用于核内的纳米定位。因制备超薄切片最初是用于电镜观察的，因此制样过程中 较多地考虑电镜观察过程中的一些要求，而并不适合AFM观察的要求。尤其是在 利用AFM的操纵功能对超薄切片表面进行纳米级的切割和操纵时，需要首先对目 标部位进行精确的定位，所以超薄切片在供AFM观察时必须首先具有适当的增强 反差的处理，以便于对目标部位进行纳米级的定位。
经对现有技术的文献检索发现，M. Melling等在《Neurolmage》(神经成像) 上发表的 "Atomic Force Microscopy Imaging of the Human Trigeminal Ganglion"(人三叉神经节的AFM成像)(2001， 14: 1348-1352)和"Morphological study of the healthy human oculomotor nerve by atomic force microscopy" (健康人动眼神经的AFM形态学研究)(2003, 20: 795-801)显示，针对未经表 面处理的超薄切片，AFM能够显示神经元或神经纤维的形态和结构，在切片表面 可以清晰地分辨有髓鞘和无髓鞘的两种神经纤维，以及轴突和雪旺氏细胞等。其
不足在于未经表面处理，对细胞核内的结构分辨不清，AFM无法在细胞核内进 行纳米尺度的定位，因此难以进行后续的操纵实验。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于原子力显微镜纳米定位的超薄切 片表面处理方法，使其用于增强切片在原子力显微镜观察时图像的反差，便于纳 米尺度的定位。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤
第一步，将超薄切片完全浸入无水乙醇处理。
所述浸入无水乙醇处理，其时间为1 min。
所述超薄切片，其厚度在50nm 70nm。
第二步，将第一步得到的切片转入双氧水处理。
所述转入双氧水处理，其时间为10 min 40 min。
所述转入双氧水处理，其间将溶液轻轻摇晃几次。
所述双氧水，其体积浓度为20%。
第三步，将第二步得到的切片转入乙醇清洗。
所述转入乙醇清洗，其时间为2 min。
所述乙醇，其体积浓度为50%。
第四步，将第三步得到的切片转入无水乙醇处理，取出晾干即成。 所述转入无水乙醇处理，其时间为1 min。
本发明这种利用化学方法进行表面处理的原理是采用一定的溶剂去除环氧 树脂，同时尽量不破坏细胞的精细结构并使之充分暴露。双氧水是常用的试剂， 价廉易得，可用于部分去除环氧树脂。其反应机制是双氧水中的过氧化氢分解产 生的活氧分子带有强氧化性，遇到网络状的环氧树脂分子链使之逐渐断裂分解， 于是环氧树脂便被慢慢溶去。需要强调的是，高浓度长时间的反应产生足够浓度 的活氧分子，会将环氧树脂连带其中的组织和细胞结构一并氧化去除，所以必须 控制反应的浓度和时间。
与现有技术相比，本发明方法仅用到两种常见试剂，处理方法简便易行，任 何人员均能独立操作，经原子力显微镜观察处理前后的超薄切片表面对比，发现 处理后切片在细胞核部位反差显著增加，便于纳米尺度的定位以及后续的纳米操 纵实验。本发明适合各种类型的超薄切片。
图1A为本发明实施例1中处理得到的切片在原子力显微镜空气中观察的图 像。图IB为本发明实施例1中同一位置在未处理之前的图像。
图2为本发明实施例2中处理得到的切片在原子力显微镜空气中观察的图像。
图3A为本发明实施例3中处理得到的切片在原子力显微镜空气中观察的图 像。图3B为本发明实施例3中同一位置在未处理之前的图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。
实施例1
将云母连带其上贴附的培养细胞超薄切片浸入无水乙醇处理1 min，然后转 入20X双氧水处理40min，再转入50%乙醇清洗2 min，最后再放入无水乙醇处 理l min，取出晾干，用AFM观察，结果如图1A。与处理前(图1B)相比，可 见图中细胞核部位经处理后得到突起的核酸样物质(箭头所示部分)，可用于核 内准确定位，也便于后续的纳米操纵实验。处理前后相比，高度反差由原来的 30 nm变为 90咖，增加近二倍。扫描范围15 umX15 u m。
实施例2
将云母连带其上贴附的培养细胞超薄切片浸入无水乙醇处理1 min，然后转 入20%双氧水处理10 min，再转入50%乙醇清洗2 min，最后再放入无水乙醇处 理l min，取出晾干，用AFM观察，结果如图2。可见图中细胞核部位经处理后 得到一团核酸样物质(箭头所示部分)，可用于准确的定位，也便于后续的纳米 操纵实验。扫描范围15 umX15 um。
实施例3
将云母连带其上贴附的培养细胞超薄切片浸入无水乙醇处理1 min，然后转 入20X双氧水处理20min，再转入50%乙醇清洗2 min，最后再放入无水乙醇处 理1 min，取出晾干，用AFM观察，结果如图3A。与处理前(图3B)相比，可
见图中细胞核部位经处理后能够得到突起的核酸样物质(箭头所示部分)，便于 准确定位到细胞核内区域，也便于后续的纳米操纵实验。处理前后相比，高度反 差由原来的 20 nm变为 50 nm，增加近1.5倍。扫描范围30 umX30 u m。
权利要求
1、一种用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理方法，其特征在于，包括以下步骤
第一步，将切片完全浸入无水乙醇处理；
第二步，将第一步得到的切片转入双氧水处理；
第三步，将第二步得到的切片转入乙醇清洗；
第四步，将第三步得到的切片转入无水乙醇处理，取出晾干即成。
2、 根据权利要求
1所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理 方法，其特征是，第一步中，所述浸入无水乙醇处理，其时间为l min。
3、 根据权利要求
1所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理 方法，其特征是，第二步中，所述转入双氧水处理，其时间为10 min 40 min。
4、 根据权利要求
1或3所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面 处理方法，其特征是，第二步中，所述双氧水，其体积浓度为20%。
5、 根据权利要求
1所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理 方法，其特征是，第三步中，所述转入乙醇清洗，其时间为2 min。
6、 根据权利要求
1或5所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面 处理方法，其特征是，第三步中，所述乙醇，其体积浓度为50%。
7、 根据权利要求
1所述的用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理 方法，其特征是，第四步中，所述转入无水乙醇处理，其时间为l min。
专利摘要
本发明公开一种用于原子力显微镜纳米定位的超薄切片表面处理方法，属于生物工程技术领域：
。将超薄切片完全浸入无水乙醇处理，再转入20％双氧水处理，其间将溶液轻轻摇晃几次，然后转入50％乙醇清洗，最后将切片转入无水乙醇处理，取出晾干即成。本发明简单易行，操作简便，效果明显，可广泛用于各种超薄切片的表面处理，能很好地增强在原子力显微镜观察时图像的反差，用于纳米尺度的定位。
文档编号G01Q30/20GKCN101187605SQ200710172592
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月20日
发明者孙洁林, 彤 季, 波 张, 张晓东, 李鑫辉, 钧 胡 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan