用至少一个检测参数筛选具有特定特征值群体的细胞或生物体的方法和装置的制作方法

专利名称：用至少一个检测参数筛选具有特定特征值群体的细胞或生物体的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及一种通过筛选具有特定特征值的细胞或生物体群体进行计数的方法和装置。该方法和装置具有研究、诊断或工业用途。具体地说，本发明直接提供了一种用至少一个检测参数和已结合了特定的单克隆抗体的微球，通过除去一些群体和/或一些子群体的方式，对重叠的群体或其子群体、生物体和由几部分组成的白血球或其子群体进行分析的手段。
本发明还涉及同样用筛选具有选择特征值的细胞和生物体群体进行计数的、具有研究、诊断、医疗或工业用途的一种分析仪和几种自动分析方法。具体地说，本发明所述的自动分析仪和分析方法把电子技术、光学技术和所选的生物分子(如抗体)的特异性独创性地结合起来，对细胞和生物体进行筛选并进行有针对性的计数，从而能对细胞和生物体的组成成份进行分类，并能确定细胞和生物体的表现型，以及血癌、淋巴瘤和稳定的肿瘤细胞的类型。
美国Coulter Electrohics Inc.of Hialeah Florida生产的A型库特计数器(Coulter Counter Moodel A)能做为一种自动血球计数器成功地对人体外周血样进行全血球自动的常规检验。仪器中的粒子探测电子系统的工作原理已由Wallace H.Coulter在美国专利US2656508(1953年10月20日批准)中披露。完全根据这种库特电子检测原理工作的粒子分析仪中避免使用昂贵而又容易出问题的光学敏感元件或激光器件。
现已对这种库特检测原理进行完善和发展，并推出许多更为精益求精的仪器，如S型库特计数器(COULTER COUNTER Moodel S)。这些仪器借助专门的计算机程序能检测全血球参数，进行细胞的绝对计数，能进行血小板计数及其形态测定，能进行红血球(RBC)形态测定，能解释正常血样和反常血样。
库特粒子电子检测原理采用了一个小孔直流馈电的孔检测电路(aperture sensing circuit)。该类粒子传感器结构简单，特别结实可靠，受到美国乃至全世界众多采用COULTER COUNTER类自动分析仪的临床实验室的称赞。1970年批准的Wallace Coulter和Walter Hogg的美国专利US3502974对这种基本的孔检测电路又做了进一步改进。除采用这种标准的直流孔供电方式外，为检测分类用的其它参数，还施加了一个高频孔径电流。高频孔径电流产生了一个反映血球的内部电导及体积的信号。由直流孔径电路同时产生的信号是一个常见的直流放大信号，该信号主要指示了细胞的体积。用一高速除法电路实现射频信号幅度和直流脉冲幅度的除法运算，所得的商通常称为“浑浊度”，它反映了细胞体积及内阻。在1970年批准的Wallace Coulter和Walter Hogg的美国专利US3502973中对该原理进行了进一步的描述。这个参数可用于细胞分类系统。一个单独的孔或者由两个相互独立的孔构成的一对孔都能用于这种用途。
在信号对产生时，对比信号对的数值，就可以对不同群体进行分类。该信号对中一个是粒子体积测量值，另一个是细胞内电导或浑浊度测量值。通常用称为散布曲线或散点图的二维曲线图来表示这类数据对。纽约州纽约市的John Wiley & Sons公司1979年出版的由Melamel Melaney和Medelsohn所编的“血球流动计数和分类”(Flow Cylometry and Sorting)一书中第371页对这种图进行了详细的阐述。
图5A示意了一正常血样的数值散布图。图中每个点代表了一个单独的细胞。基线以上的高度值表示细胞的相对体积，图中点离开垂直基线向右的距离表示相对浑浊度。正常白血球(WBC)散布图(已将血样中的红血球去除)中有三群体，表明可以根据这些细胞的大小和内部构造的内在差别将这些细胞分为三个不同的群体。如果需要的话，可以用适当的电路对这几个群体的每一个计数。可以根据这些内在差别对细胞进行分类。
以前的库特粒子电子检测原理的专利申请都是先进行红血球计数，然后再进红血球其它参数的复杂的测定工作，然后从整个外周血样中除去红血球，只要除去红血球的过程不显著影响待测的剩余白血球的群体性质，就可以进行白血球群体测定了。为此而研制了许多红血球溶解剂。虽然这些试剂行之有效，用途广泛，但用于下面的白血球测定时仍不尽令人满意。
以前的单用直流体积法或对应不同角度进行光散射的白血球流动分析法表明血样中有三群白血球，它们分别对应于淋巴细胞、单核细胞和粒性白细胞。粒性白细胞又包括嗜中性白细胞、嗜碱性白细胞和嗜曙红细胞三个群体，可以对一些血样的嗜曙红细胞的浓度做出粗略但却有用的估计。用这种方法测出的第五个重要群体的量很小。采用特殊的荧光技术可以证明，嗜曙红细胞也被作为一个明显群体观测。
这些荧光技术已用于库特公司生产的流动式血球计数器(如EPICS类流动血球计数器)上。这类仪器采用的原理是使细胞在一阳极(sheath)流确定的园筒形液流中流动，这些细胞在流动过程中排成一列，逐个通过一束激光，用来自这些细胞的散射光信号和/或荧光信号可能对这些细胞的群体进行分类。对带有吸收染料或荧光染料的染色细胞还可能进行进一步的细胞群体分类。R.C.Leif等在“临床化学”(Clinical Chemistry)第23卷(1977年)第1492-98页中还进一步讲叙了多参数自动分析的仪器和荧光染料的发展情况。由于这些技术的进步，使我们已能同时对白血球进行群体分类到四种。这四种白细胞分别是淋巴细胞、单核细胞、嗜曙红细胞和“粒性白细胞”(嗜中性白细胞和嗜碱性白细胞)。
更新的血液学分析仪器把光散射技术和细胞的过氧化物酶染色(用吸收性染料)技术结合起来，把白血球分成五种区别类别。此外，把染料及特异反应性生物分子(如单克隆抗体)结合起来增加了白血球的类型数目，还可能对其进行功能性细分。
本发明的第一个原始申请(美国申请号025345，申请日1987年3月13日)公开了一种原理相同的改进的全自动分析方法和仪器，该申请的名称是“用于筛选细胞或生物体以对具有特定的特征值的群体进行计数的自动分析方法和分析仪”，该原始申请将电子检测孔径原理的采用、用于对细胞或生物体的特定群体进行鉴定和/或计数的特定的生物分子的特异性以及微观粒子技术结合起来。该自动分析仪可把特定溶剂和抗体一起应用。这些抗体键合到可以由多种成分构成的极细的微球或支持物上。
本发明的第二个原始申请的美国入藏号为285856，申请日为1988年12月16日，名称为“用于筛选具有特定的特征细胞和生物体计数的方法和装置”。该申请公开了直接筛选全血或血样中某些部分的子群体的技术。
选择附上细微颗粒可能使表示至少一个群体原来位置的参数发生改变。细微颗粒大量加入到某些选定的目标群体中，使测得的体积和/或浑浊度发生改变，从而使代表一个群体的点的位置发生偏移。
用已知其特异性的抗体来涂覆细微颗粒。涂复使颗粒能选择性地吸附那些表达对某种抗体特异的抗原的细胞。这些涂复细胞(或称标记细胞)是颗粒和细胞的组合物，它们就象新的实体一样。可以考虑用这些组合物的混浊度、体积或者混浊度一体积数组参数来代表细胞和颗粒对获得信号总的影响。如果组合物组分的性质发生变化，新的实体依照最后的影响将移至一个新位置。将新位置与对应于单独细胞的旧位置相比较，就能够对这些新实体或实体组进行分类。如果吸附在细胞上的颗粒是磁性颗粒，那么就象现在采用的那样，可以用磁铁来捕获这些新实体。如果二者迅速混合，就会产生出人意料的效果既能完全捕获一个群体，同时又不破坏所研究的细胞的性能。
利用在此以前提到的直流体积和混浊度参数固有的独特性质只能从一个血样中对细胞的三个特征群体进行计数和鉴别。为对更多的群体进行计数和检测，必须另外采用一些步骤，如采用改进的溶解系统。当然，这些新的群体是对应于淋巴细胞、单核细胞和粒性白细胞的三个基本群体的子群体。原申请中所施行的步骤表明了如何获得这三个基本群体的子群体。
采用简单的孔径检测技术，同时结合两种或更多种生物颗粒的特性，就可以得到代表一给定群体的点聚集中的一个新的独特的位置。群体在点阵图或散点图中的这种有选择性的位置移动是可重复的，因而可用来从三个基本群体鉴别一个群体。
通过把各微球逐一地吸附在各选定的细胞上，可以对原有的直流体积和混浊度检测技术原来固有的组合做出进一步的改进。通过对颗粒表面的涂复，生物分子和抗体相对于其它分子的自然属性(或称特异性)赋予了这些颗粒以选择性。表面未给含颗粒的细胞中的某一个群体或子群体没有任何区别，因而也无法在图中区分出它们。可以用这种方式向欲鉴别、计数和研究的某一特定的细胞群体中加入能选择吸引该群体的颗粒。向感兴趣群体的各种群体有选择地加入足够量的选择性颗粒将引起质量、体积和混浊度新的独特的重新组合，这将导致该群体的点阵位置发生偏移。
特定细胞群体的分离并不引起其它细胞群体性质的本质改变。比如，根据本发明的方法从全血样中除去红血球(RBC)后还可以进行T4和/或T8淋巴细胞的测定，而这种测定对采用前面提到现有的红血球化学溶解试剂是不可能实现的。现已用T4与T8细胞的数目比来判断是否具有免疫缺陷，而这些免疫缺陷则对应着众多的病毒感染中的几种(包括爱滋病毒感染)。可以用在细胞表面设置特殊受体的方法来把某一群体分成数个子群体，对这些子群体的计数可以表明是否将有疾病发作。比如，几个主要类型的白血病病人在病情发作时都伴随着外周血淋巴细胞的急剧增多。如果迅速增殖的淋巴细胞子群体带有T11受体，那么病人是处于免疫系统异常危险境地。
再者，如果T11阳性淋巴细胞的子群体是携带T4受体，那么病人就将按日本常用的方式分类。由于细胞上带有至少两个有关的受体或抗原，因此称这些细胞发生了“重叠”。重叠率是诊断和治疗过程中的一个重要参数。正常全血样中群体重叠的一个例子是CD2和CD8子群体的重叠。群体异常重叠的另一例子发生在慢性淋巴细胞白血病患者上，患者在发病时其CD5和CD20子群体发生重叠。此外，如果T4受体子群体在增殖时表现为ZH4阳性，那么患者不仅容易发生复合感染，而且也是急性血癌，同样因为T11、T4和ZH4阳性细胞诱发了抑制过程，功能性地抑制了患者产生抗体的功能。这样，病人就处于复合感染的威胁下，必须对患者同时做血癌和免疫缺损治疗。这些内容可参见GANN Monograph on Caser Research第28卷(1982年卷)第13-22页K.Takatsuki等人的文章;C.Morimoto等在Coulter Japan Symposium文集上的文章(1984年);C.Morimoto等人在Immunology第134卷(1985年)第3期1508～15页上的文章;C.Morimoto等在New England Journol of Medicide第316卷(1987年)第2期67～71页上的文章。本发明也适用于生物体悬浮液的分析，比如用于细菌和病毒与其它成分混合的悬浮液体系的分析。
本发明的方法和装置采用了许多免疫反应，比如试剂与生物体或细胞的反应。此外“细胞”一词专指动物或植物细胞，这些细胞或者彼此分开识别，或者聚集在一块。细胞是生物中具有独立的功能的单元中最低等的结构聚集体。比如，这些细胞可以是从组织或血样中采集的人类红血球和白血球群体，癌细胞或其它异常细胞。生物体仅限于细菌、病毒和真菌，也可包括一个底物。本发明可用于病人的诊断、监测或处理。本发明专用于消除和移动某些群体，以对那些用其它方法不容易鉴别的群体或子群体进行分析。凡是可标记的细胞和生物体都可适当地用本发明的方法和装置象鉴定人类血球血样那样进行测定。参数变化的检测与底物的情况或有无底物无关。
本发明提供了一种由一个通用分析仪和分析方法，该分析仪和这些分析方法仅仅把最必要的电子技术和(或)粒子的光检测技术以及特定生物分子的特异性结合起来，把用于临床实验室和有工业用途的自动分析仪的领域的技术水平推进了一大步。对多种白血球子群体的测定以及人类外周血中白血球的各个子群体相互关系的研究对人体疾病的医学研究和诊断是非常重要的。这类数据用作鉴定和分类疾病(血癌)的筛选工具。用本发明仪器所能鉴别的异常情况可以在广阔的研究领域内提供与诊断有关的信息，而不限于白血球群体的检测，这点从说明书和附图等文件中可以看得很清楚。
本发明最有价值的特征之一是它仅需采用一个严格的库特检测装置。该装置工作稳定，不需要复杂而耗资的光学系统，不过如果需要的话也可采用光检测装置。附加的射频信号发生器和检测器所要求的电路是经济的，且坚实的，可靠的。整个装置只需一个孔径就行了，不过如果采用第二个甚至第三个孔径将使装置获得比较合算的更大的样品通过率。
下面将叙述一种用于执行筛选细胞或生物体并对其群体进行计数以鉴别由细胞或生物体或其子群体所具有的选定的特性或性质的方法和装置。根据本发明可以从一全血样或从一红血球和/或白血球的群体已被除去的血样中，通过从血样中除去某些群体和/或其子群体的方法对白血球多个(或称五个)有差别类型进行测定，还可以完成淋巴细胞的各子群体测定和重叠测定。
可以再用从血样中除去一些群体和/或子群体的方法，把一全血样或其一部分进行筛选，以提供所希望的白血球群体分析。通过除去重叠的细胞或生物体，分别或一起分析细胞或生物体的各群体或子群体的重叠情况。从血样中去除或予先去除红血球群体，不会明显影响有关的白血球群体和其子群体的特征值。
从一个血样中至少基本贫化一个白血球群体子群体，然后至少将该群体和子群体的分析结果同贫化白血球群体的情况相比较，以确定白血球群体的至少一个特征值。从一样品中至少扣除一个白血球群体子群体，然后对样品中扣除的被分析的部分和原来的那部分并比较，以确定用其它方法不容易得到的白血球群体的百分率。然后，分别从样品的不同部分贫化各白血球子群体，并将结果同原来样品的情况进行分析和比较，以确定抗原在至少两个白血球子群体中的重叠情况。
因此，本发明的第一个目的是提供一个从至少具有白血球群体和/或子群体的一全血样中的至少一部分中获得至少一个白血球群体分析结果的方法，该方法的特征在于通过对所述全血样的至少第一部分进行分析，以确定至少一个带有所述的全血样特征的白血球群体或子群体，至少从所述的全血样的第二部分中基本上贫化至少一个白血球群体或子群体;对所述的全血样的第二部分进行分析，以确定至少一个所述的第二部分的白血球群体或子群体特征值，对所述的两个分析过的特征值进行比较，以确定至少所述全血样品一个白血球群体或子群体百分率。
本发明的第二个目的是提供一个从一至少具有白血球群体和/或其中的子群体的全血样中的至少一部分中获得至少一个白血球群体分析结果的装置，其特征在于用于对所述全血样的至少第一部分进行分析，以确定至少一个所述的全血样品的白血球群体或子群体特征组件;用于从所述的全血样的至少第二部分中基本上贫化至少一个白血球群体或它的子群体的组件;用于对所述的全血样的第二部分进行分析，以得到至少一个带有所述的第二部分白血球群体或子群体特征的组件;用于对所述的两个分析过的特征进行比较，以确定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体百分率的组件。
本发明的第三个目的是提供一个从其中至少带有白血球群体的一个全血样的至少一部分中提高和获得至少一个白血球群体或白血球群体子群体的分析结果方法，其特征在于对所述的全血样的至少一个第一部分进行分析，以确定至少一所述的全血样的白血球群体或子群体特征值;从所述的全血样中的第二部分减去至少一个白血球群体或白血球群体子群体，因为该白血球群体或其子群体会遮蔽对所要求的白血球群体或白血球群体的子群体的分析结果;对所述的全血样的第二部分进行分析，以确定所述的第二部分有关的白血球群体或白血球群体的子群体特征值;对所述的两个分析过的特征值进行比较，以确定所述的全血样品有关的至少一个所希望白血球群体或白血球群体的子群体百分率。
本发明的第四个目的是提供一个用于从其至少带有白血球群体的一个全血样的至少一部分中获得至少一个白血球群体或白血球群体子群体的分析结果并放大该结果的装置，其特征在于用于对所述的全血样的至少第一部分进行分析，以确定至少一个所述的全血样的白血球群体或白血球群体子群体特征的组件;用于从所述的全血样中的至少第二部分中减去至少一个白血球群体或白血球群体子群体的组件，因为该白血球群体或白血球群体子群体会遮蔽所希望的白血球群体或白血球群体子群体的分析结果;用于对所述的全血样的第二部分进行分析，以确定至少一个所述的第二部分的有关的白血球群体或白血球群体子群体特征值的组件;用于对所述的两个分析过的特征值进行比较，以确定所述全血样的至少一个所希望的白血球群体或白血球群体子群体的百分率的组件。
本发明的第五个目的是提供一个从一至少具有两个子群体的全血样中的至少一部分中得到至少两个白血球子群体中重叠群体的百分率的方法，其特征在于对所述的全血样的至少第一部分进行分析，以确定所述全血样的至少一个的白血球群体特征值;从所述的全血样中的至少第二部分中基本贫化所述的白血球子群体的至少第一子群体;对所述的全血样的第二个贫化的部分进行分析，以确定所述的白血球群体或第一子群体的至少一个特征值;从所述的全血样中的至少一个第三部分中基本上贫化所述的白血球子群体中的至少一个第二部分;对所述的全血样的第三个贫化部分进行分析，以确定所述的白血球群体或第二子群体的至少一个特征值;对上述的三个分析得来的特征值进行比较，以确定所述全血样的两个白血球子群体的抗原的重叠率。
本发明的第六个目的是提供一个从一至少具有两个子群体的全血样中的至少一部分中得到至少两个白血球子群体中重叠群体的百分率的装置，其特征在于具有对所述的全血样的至少第一部分进行分析，以确定至少一个所述的全血样的白血球群体的特征值组件;具有从所述的全血样中的至少第二部分中基本贫化所述的白血球子群体的至少第一子群体的组件;具有对所述的全血样的第二个贫化部分进行分析，以确定所述的白血球群体或所述第一子群体的至少一个特征值的组件;具有从所述的全血样中的至少第三部分中基本上贫化掉所述的白血球子群体中的至少第二部分的组件;具有对所述的全血样的第三个贫化部分进行分析，以确定所述的白血球群体或第二子群体的至少一个特征值的组件;具有对上述的三个分析得来的特征值进行比较，以确定所述全血样的两个白血球子群体的抗原的重叠率的组件。
本发明的优选实施例将在下面一一列出。参见说明书的附图，其中

图1～13为申请号025345的本申请的第一个原申请所述实施例的示意图。
图1是原申请中一个细胞群体分析仪的实施例的示意框图;
图2是原申请中第二种分析仪的实施例的示意框图;
图3示出了一种相应于图1和图2中原申请的一种特殊的分析仪的实施例;
图4是原申请中另一种分析仪的实施例的示意框图;
图5A和5B是根据与图2和3所示的系统相似的分析仪的原型机所得到的一组结果绘制的一个散点图;
图6是原申请中第四种分析仪的实施例的示意框图;
图7是原申请中第五种分析仪的实施例的示意框图;
图8A和8B，9A和9B，10A和10B，11A和11B是根据与图6和7所示系统相似的一种原型分析仪系统所得到的一系列结果绘制的散点图;
图12是原申请中第六种分析仪的实施例的示意框图;
图13是根据与图12所示系统相似的一种原型分析仪系统所得到的一组结果得出的散点图;
图14-26D是申请号为285856的本申请的第二个原申请所述实施例的示意图;
图14是原申请所述的一个有关白血球群体子群体分析仪的实施例的示意框图;
图15是原申请所述的另一个有关白血球群体子群体分析仪的实施例的示意框图;
图16是相应于图14和15的原申请所述的一个有关一种特殊的分析仪的实施例的示意图;
图17A和17B是根据与图3和16所示系统相似的一种原型分析仪系统所得到的一组结果得出的散点图;
图18A是应用与图16所示系统相似的一种原型分析仪系统得到的L.M和G群体的散点图，图18B是根据与图16所示相似的一种原型分析仪系统得到的L、M和B群体的散点图;
图19A-D，20A-D和21A-D是不同患者的血样中CD4，CD8，CD2和CD20子群体的散点图;
图22A是一与图18A中散点图相似的散点图，图22B是表明E和N群体发生偏移的散点图，图22C是表明E、N和CD4群体发生偏移的散点图;
图23A-D是表明用使一个微球与有关的白血球子群体键合，并使第二微球键合到第一个微球的方式获得的白血球子群体的直接分析结果的散点图;
图24A-C为表明用于原申请的偏移分析中的微球粒度大小的影响的散点图;
图25A-D是采用原申请的技术同时分析两白血球子群体结果的散点图;
图26A-D是相同种群体关于不同参数的散点图;
图27-46用于说明本发明的实施例;
图27是本发明中有关一种单检测参数白血球群体子群体分析仪的实施例的示意框图;
图28为相应于图27的本发明中一种特殊的分析仪的实施例的示意图;
图29A-D是采用与图27和28所示的装置相似的一种原型分析仪系统和一种直流检测参数得到的一组结果的散点图;
图30A-D是采用一射频检测参数得到的与图29A-D结果相同的散点图;
图31A-D是采用与图27和28所示装置相似的一种原型分析仪系统和一直流检测参数得到的第二组结果的散点图;
图32A-D是采用一射频检测参数得到的与图31A-D相同的结果的散点图;
图33-36是用一个光检测参数所得结果的散点图;
图37为一种能增强子群体或遮蔽群体信号的白血球群体子群体分析的示意框图;
图38A-E为采用与图27和37中相似的一种原型分析仪系统和一射频检测参数得到的一组结果的散点图;
图39A-E为采用一种直流检测参数得到的另一组结果的散点图;
图40A-E为采用一种射频检测参数得到的同一组结果的散点图;
图41A-E为采用两种检测参数得到的一组结果的散点图;
图42A-G和图43A-G为分别对两种有关的异常血样采用不同的检测参数得到的结果的散点图;
图44为本发明中用于细胞的重叠率分类测定的一种白血球子群体分析实施例的示意框图;
图45A-D和46A-D为采用与图27和44中相似的一种原型分析仪系统和直流检测参数所得的两组结果的散点图;
图1-13描述了申请号为025345的第一个原申请的实施例。
参见图1，申请号为025345的原申请所述的一个细胞群体分析方法和装置的第一个实施例用(10)来表示。分析仪(10)中包括一生物样品(12)，该样品至少含有第一组活的生物细胞(图中未示出)，这些细胞或者处于一全血样中，或者来自一全血样。生物样品(12)中的这些细胞将包括于某一进行定量和/或定性分析或测定的生物反应。样品(12)可包括一缓冲溶液，那些细胞就加入其中。
把样品(12)经管路(14)与来自管路(18)的至少一种试剂(16)相混合。然后红血球(RBC)被一根据其功能命名的红血球分离装置(20)从混合液中分离出。用装置(20)从混合物中分离出红血球的方式有几种。红血球可被试剂(16)中的一种溶剂溶解。申请号为130911，申请日为1987年12月10日，名称为“用于从全血样中分离、鉴定和/或分析全血样的白血球的方法和试剂系统”的专利申请中公开了一种可用于此处的一种溶剂和一种猝灭剂。该申请是申请号为025303、申请日为1987年3月13日、名称相同的专利申请的一份后续申请，这两份申请可供参考。试剂(16)可以是或包括许多磁性微球，每个磁性微球带有一个对与微球键合的红血球特异的抗体(图中未示出微球)。在本实施例中，对红血球特异的抗体用的就是申请号为799，489、申请日为1985年11月19日、名为“用于分离人类外周血中白血球回收的单克隆抗体和回收使用所述的单克隆抗体的方法”的专利申请中公开的那种单克隆抗体。该份申请可供参考。试剂(16)也可包括一种缓冲溶液，该缓冲溶液或者可替代样品缓冲溶液，或者是与之无关的另一种缓冲溶液。试剂(16)还可以是优选的红血球溶剂和对红血球特异的微球的组合物。
一旦红血球被从混合物中基本上分离出去，将一部分混合物通过管路(24)输入白血球分析器(22)中。白血球分析器(22)至少可以对混合物中的白血球进行计数，它可以测量白血球的体积，浑浊度等参数中的某一个或多个参数。分析器(22)的结果经线(28)输入到比较器(26)中。
把红血球贫化的混合物的第二部分经管路(32)送至一白血球子群体减去装置(30)。从混合物中减去白血球可以有几种方法。可以把一些带有一个对某个白血球子群体特异的单克隆抗体键合微球加入混合物中，非磁性微球可以与白血球键合，从而改变细胞总的混浊度或体积参数，或者说使之偏移。磁性微球也能与白血球键合，然后可以用磁场将白血球从混合物中分离出来。
将白血球子群体已被除去的混合物经管路(36)送至白血球子群体分析器(34)，或者其一个或多个参数发生变化。分析器(34)可能与分析器(22)完全相同。把分析器(34)得出的结果经线(38)送到比较器(26)中。然后比较器(26)把来自分析器(22)的结果同来自分析器(34)的修正过的结果进行比较，以确定选定的白血球群体的至少一个特征值，比如一特定范围内白血球的数目。
参见图2，原申请所述的细胞群体分析方法和装置的第二个实施例一般用(40)来表示。分析仪(40)中包括一个生物样品(42)，该样品也至少含有一第一组活的生物细胞(图中未示出)，这些细胞或者处于一全血样中，或者来自一全血样。生物样品(42)中的这些细胞包括在某一进行定量和/或定性测定和分析的生物反应。样品(42)也可包括一缓冲溶液，那些细胞就加入其中。
样品(42)经管路(44)与来自管路(48)的至少一种试剂(46)相混合。在分析仪(40)中，红血球被一根据其功能命名的红血球分离和白细胞移位装置(50)从混合物中除去，装置(50)还同时改变或移动至少一个白血球子群体中的至少一个特征值。如上所述，红血球分离装置(50)从混合物中分离出去的几种方法与前面装置(20)所列举的方法相同。同时，在混合物的同一部分中，白血球通常与非磁性微球相键合，使细胞的结果的混浊度和/或体积参数发生改变或者偏移。
将已去除红血球并且白血球子群体已发生偏移的混合物经管路(54)送至分析器(52)。分析器(52)与分析器(22)基本上相同。分析仪(40)能直接对某一选定的白血球群体或白血球子群体的至少一个特征值进行快速直接分析。
在图3中，原申请中有关一个按第一分析仪(10)和第二分析仪(40)所采用的方法工作的分析仪装置的特殊实施例一般用(56)来表示。
仪器(56)中只示出了一种特定的计数装置，不过可以根据原申请的原理对其做出不胜枚举的改变。此外，图中只示出了仪器(56)的功能性细节，而这类实施例在结构上可能有许多方法来实现。
仪器(56)包括一个吸液泵机构(58)，用该泵可将有关的生物样品如样品(12)或(42)吸进仪器(56)中。吸液泵(58)经管线(60)与取样阀(62)相连，阀(62)又与样品探头(63)相连。图中的溶剂泵(64)可包括溶剂，比如试剂(18)或(46)的一部分，并且泵(64)经管路(66)与阀(62)相连。在适当的时候阀(62)和泵(58)可把样品(12)或(42)并经泵(64)与溶剂一起吸入。
然后，把试剂混合物或生物样品本身经排液管路(68)送入混合装置(70)中。混合装置(70)包括一混合容器(72)，样品或试剂就送入混合容器(72)中。到此处分析仪(10)和(40)的工作过程已有区别，因此下面将分别说明。
就分析仪(10)的情形而言，如果红血球已被来自泵(64)的溶剂溶解，那么当反应结束后将猝灭剂或固定剂从装置(74)中经管路(76)加入到容器中。可以在容器(72)中将溶剂和样品混合，以促进该反应的进行，这个功能用(78)来表示。
申请号为025337、申请日为1987年3月13日，名称为“用于小体积样品快速混合以加快生物反应的方法和装置”的专利申请公开了一种适用于此处的混合装置(70)的细节，该申请可供此处参考。通过采用混合装置(70)，反应速度大大提高，而有关细胞的性质并不象采用提高反应温度的方法那样容易明显受损。此外，反应时间通常远远短于1分钟，一般为15秒左右或者更短，这就使大容量自动分析仪(50)能进行快速分析。
然后，把被猝灭的试剂，该试剂被来自装置(20)的溶剂去除的红血球，沿管路(80)送至保持容器(82)，在这种情况下容器(82)将混合物中第二部分存储起来，而混合物中的第一部分将从容器(82)沿管路(84)被送至白血球分析器(86)(即分析器22)。根据Wallace H.Coulter在美国专利US 2656508中公开的计数技术和大小测量技术(这些技术已体现在专利受让人Coulter电子公司制成的各种商用血细胞计数器上)，分析器(86)可以有很多种结构类型。
分析器(86)通常包括一个流动检测器或测试容器(88)。容器(88)包括一个有孔(92)从其中穿过的传感器(90)。容器(88)还包括第一部分(94)，该部分中有一与其中流体相接触的第一电极(96)。
容器中部分(94)和电极(96)通过孔(92)与容器中第二空间(98)相通，空间(98)中第二电极(100)。
电极(96)和(100)经电抗线(102)和(104)与一射频/直流源和检测电路(106)相连。电路(106)既与电极(96)和(100)之间的一直流或低频电流(或信号)相耦合，又与电极(96)和(100)之间的一高频信号相耦合。
低频信号用于检测一细胞穿过孔(92)引起的信号脉冲的幅度。高频信号用于获得同一细胞穿过孔(92)时产生的混浊度电信号。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在受让人库特电子公司(Coulter Electronics，Inc.)所持有的美国专利US3502974及随后几篇专利及非专利出版物中讲叙了如何测量细胞的混浊度电信号。原申请号为168008、申请日为1986年10月21日、现申请号为921654、名称为“用于测量粒子阻抗和电抗的粒子分析仪”的美国专利申请中公开了一种可用于此处的专用电路，该专利申请可供参考。
电路(106)产生的反映被检测细胞的信号沿一直流信号线(108)和一射频信号线(110)传到一比较器(112)中(该比较器与比较器(26)相似)。比较器(112)能够将从第一部分(即白血球子群体未被扣减的那部分)产生的信号存储起来，以供与下面将要讲到的从第二部分产生的信号相比较用。
分析器(86)包括一阳极(Sheath)流装置，其作用是用众所周知的方式使探测器(88)中的细胞集中。阳极(Sheath)流可由一射流系统(114)来提供。该系统通过线(116)和(118)以众所周知的方式与探测器(88)相连。反应样品混合物可通过一引导管路(120)流入探测器(88)，并从探测器(88)中出来，经排液管(122)流入废液池(124)。
当混合物的第一部分在分析器(86)中分析时，第二部分暂时存储在容器(82)中，此时用来自冲洗管路的(126)的液体清洗或冲刷混合器(72)，冲刷液经废液管(128)流出。一旦容器被冲洗完毕，第二部分就沿管路(130)被送回容器(72)。与装置(30)的情形相似，通过管路(134)、阀(136)和一容器管路(138)加入来自装置(132)的白血球微球，把白血球子群体去掉。
用混合机构(78)使白血球微球与第二部分相混合。如果白血球是非磁性球，将反应混合物同键合了白血球的微球一起经管路(80)、容器(82)和管路(84)送入分析器(84)(即分析器34)。第二部分在分析器中的分析过程与第一部分相似，然后把分析结果在比较器(112)(即比较器26)中进行比较。第二部分中至少有一种白血球子群体的细胞参数发生了变化，比如细胞的混浊度受与白血球子群体相键合的微球影响发生了变化。由此得到的变化了的结果将在以后进行分析。
如果白血球微球是磁性微球，那么当混合过程正进行时和/或混合完以后，可以用一磁场或一磁铁(140)将键合到微球上白血球分离出。磁场可由电磁装置提供，也可由一相对于容器(72)作物理运动的磁铁(140)来提供。该磁场能捕获与磁性微球相键合的白血球子群体。然后，用前述的方式把没有键合的白血球子群体的第二部分经管路(80)、容器(82)和管路(84)送入分析器(86)(该分析器与分析器(34)相似)。
然后，准备仪器(56)，使之能够接受用于下一个分析的样品。探头(63)可以用一探头冲淋机构(142)来清洗，各管路、容器(72)和(82)可用常规方法冲刷清洗。对随后的样品混合物的每次分析都自动快速地得到。对各样品混合物的分析的间隔期在分钟数量级，或者更短。
分析仪(56)的工作过程与分析仪(40)相似。工作时，将带有白血球溶剂/试剂(46)的反应混合物和样品(42)连同来自装置(132)的非磁性白血球微球在容器(72)中混合，非磁性白血球微球同白血球的一个子群体相键合。把猝灭剂(74)加入反应混合物中，然后沿管路(80)、容器(82)和管路(84)送入白血球分析器(86)，供分析用(分析器(86)与分析器(52)相似)。
如果不使用溶剂，那么另一个方案是在分析仪(10)和(40)的某一个中，将样品(12)或(42)经阀(62)送入混合器(70)，这中间不涉及任何溶剂。就这种情形而言，可以采用来自红血球微球库(144)的结合了一个对红血球特异的抗体的磁性微球将红血球去除。然后，将混合物经管路(146)送至阀(136)，再经管路(138)送入容器(70)。该过程中不用任何溶剂，键合后的红血球混合后的磁性分离是用与上述同磁球键合的白血球分离方式基本相同的方法用磁铁(140)来完成的。
此外，在第二种提高反应速度的情况中，采用的是样品同红血球溶剂以及红血球磁球的反应混合物。然后，用上述方法将反应混合物的各组份充分混合，溶剂是猝灭剂，用磁铁或电磁场去除红血球键合体，再如上所述对白血球进行分析。
参见图4，原申请中所述的有关一种细胞群体分析方法和装置的另一个实施例一般用(148)表示。分析仪(148)包括一生物样品(150)，该样品又包括至少第一组活的生物细胞(如一全血样中或来自一全血样的细胞)。样品(150)也可包括一种缓冲溶液，细胞就加入到这种缓冲溶液中。
样品(150)经管路(152)与沿管路(156)而来的至少一种试剂(154)相混合。然后按上述方法用一根据功能命名的红血球分离装置(158)将红血球分离出。将红血球已去除了的反应混合物沿管路(160)送入一白血球分析器(162)。将分析器(162)得出的结果经线(166)送入一比较器(164)，得出一个表明白血球中对应于单核细胞M、淋色细胞L和粒性白细胞G的三个区别类型的结果。
然后将混合物经管路(170)送至一根据功能命名的嗜中性白血球(N)分离装置(168)。可以用如上所述的方式通过位移或改变一个参数(如混浊度)，或用磁去除方式把嗜中性白血球从混合物中除去。在这个例子中使用的那个对嗜中性白血球特异的抗体，即原申请号为168306、申请日为1986年12月8日、现申请号为938864、名称为“对嗜中性白血球特异的单克隆抗体”的美国专利申请中公开的那种单克隆抗体。
然后将嗜中性白血球已被去除、或者参数发生位移的混合物经管路(174)送入另一白血球分析器(172)。将分析器(172)得出的结果经线(176)送入比较器(164)。分析器(172)得出的结果获得白血球中有四种不同类型，其中两种对应于单核细胞M和淋巴细胞L，不过由于嗜中性白血球已被除去或者其参数发生了位移，结果还得到另外还存在两种对应于嗜曙红细胞E和嗜碱细胞B的区别类型。然后，比较器(164)对来自分析器(162)和(172)两个分析结果进行比较，比较结果构成了白血球的五种区别类型。特别需要说明的是，粒性白血球数减去嗜碱细胞数和嗜曙红细胞数得到的就是被去除的嗜中细胞数。
现在参照图5A和5B与分析器(148)相似的原型分析法从一全血样中得到的两组散点的示意图。生物样品(150)是体积为20微升的全血样品。将20μl样品与40μl已键合了对红血球特异的抗体的磁性微球相混合，再与140μl的缓冲溶液混合，就制成了反应剂(154)。将反应混合物搅拌混合15秒，再在装置(158)中的一磁场中放置10秒。然后用分析器(162)对红血球已被去除了的混合物进行分析。分析结果中，图5A的散点图表明L计数值为45.6(1)，M计数值为5.6(2)，G计数值为48.7(3)。
然后，把混合物同10μl已键合了对嗜中性白血球特异的抗体的磁性微球在装置(168)中进行混合，搅拌混合时间为30秒，然后把混合物移至一磁场中放置10秒。然后把嗜中性白血球已被去除了的混合物送入分析器(176)，得到散点5B。该图表明L计数值为81.0(1)，M计数值为0.6，E值为11.0(3)，B值为1.8(4)。然后比较器(164)得出白血球五种区别类型的计数值分别为L计数值45.6，M值5.6，N值41.6，E值6.0，B值1.2。这个结果与用标准的白血球显微分析法(该方法采用Wvight着色剂对载片上的样品进行着色处理)所得到的计数值L为44.0，M为3.4，N为45.0，E为6.1，B为0.4)相对应。
图6是原申请中有关一种细胞群体分析方法和装置的一个进一步的实施例的示意图，该实施例在图中一般用标号(178)来表示。分析仪(178)包括一生物样品(180)。该样品中含有至少一个第一组活的生物细胞，同时该样品也可能包括一缓冲溶液。
样品(180)经管路(182)与来自管路(186)的反应剂(184)结合。将混合物中的第一部分经管路(188)送到一根据功能命名的红血球和嗜中性白血球分离装置(190)，该过程原理如图所示。用前述方法将红血球和嗜中性白血球分离出或使之移位，然后把第一部分经管路(192)送入白血球分析器(194)。
由此就可以从分析器(194)中得到一个结果，再把该结果沿线(196)送至比较器(198)。该结果包括上面提到的白血球的四个区别类型(即单核细胞、淋巴细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞)的情况。
同时，把样品(180)和试剂(184)组成的混合物的第二部分经管路(200)送至根据功能命名的红血球分离装置(202)，再把红血球已被去除了的混合物经管路(204)送至另一个白血球分析器(206)，把分析器(206)得出的结果经线(208)送入比较器(198)。分析器(206)的结果直接地包括上述的白血球的M、L和G三种区别类型。比较器(198)对分析器(194)和(206)的结果作出比较，给出白血球的五个区别类型的情况。
图7中，(210)表示一种采用了分析器(178)的方法和装置的特殊的分析装置的实施方案。图中也只示出了特殊的计数部件，不过同分析仪(56)一样，分析仪(210)也可以具有很多种结构。
仪器(210)包括一吸入清洗机构(212)，该机构经管路(216)与取样阀(214)相连。阀(214)包括一样品探头(218)，它能吸入所需的生物样品，如样品(180)。稀释剂输送泵(220)经管路(222)通向阀(214)，该泵能在需要时提供稀释样品(如一全血样)所需的稀释剂。然后将混合物的第一部分经管路(224)和(226)送入第一混合装置(228)。同时，把混合物的第二部分经管路(224)和(230)送入第二混合装置(232)中。
混合器(228)(与装置(190)类似)与另一个同装置(202)类似的混合器(232)基本相同，下面先介绍混合器(228)。混合器(228)包括一混合容器(234)，混合物的第一部分就送入到该容器中。混合器(228)的构成可以采用上述的所有方案，必要时还可包括一输送红血球溶解的溶剂输入管路(236)。
如果采用溶剂，混合物在图中示出功能的装置(238)中混合后，将猝灭剂经猝灭管路(240)加入混合物。同时，将其上已键合了对嗜中性白血球特异的抗体的适当的磁性或非磁性微球从微球源(242)、经管路(244)送入容器(234)。如果对嗜中性白血球或红血球采用的是磁性微球，那么需用磁铁(246)或一磁场去除与磁性体结合的细胞。
然后将混合和猝灭(需要时才这样做)后的混合物经管路(248)，通过阀(250)和管路(252)送入白血球分析器(254)(即分析器(194))。分析器(254)即分析器(86)，此外不再对其作详细说明。分析器(254)中也包括一检测容器(256)，容器中有一通孔(258)，混合物和细胞就从该孔通过。阳极(Sheath)流射流系统(260)与容器(256)相连。如前所述，用一射频/直流源和检测电路(262)检测细胞发出的信号，将该电路的输出送入比较器(264)。
同时，将混合物的第二部分送入混合容器(266)中。在第二部分混合物中，只去除红血球(即象装置(202)的功能)，红血球是由经管路(268)送入容器(266)的红血球溶剂去除的。将溶剂同样品混合，再加入来自猝灭剂管路(270)的猝灭剂，此外，也可用已键合了对红血球特异的抗体的磁性微球去除红血球，这些微球从微球源(272)经管路(274)被送入容器(266)中。在(276)处完成对微球的混合过程，然后用磁铁(278)去除与磁性体结合的红血球微球。
然后把红血球已被去除了的混合物经管路(280)送至阀(250)，再经管路(252)送入分析器(254)，以得到上述结果。混合器(228)和(232)分别具有适用的冲淋管路(282)和(284)以及废液管路(286)和(288)，并共用一个探头冲淋器(290)，以便在吸入下一个样品或正准备分析的样品前清洗分析仪(210)。
图8A和8B是用与分析仪(178)所采用的相似的分析方法从一全血样得到的结果的散点图。在本例中，20μl的全血样形成样品(180)，用40μl其上已结合了对红血球特异抗体的磁性微球同140μl缓冲溶液混合，形成了反应试剂(184)。把混合物的一部分在装置(202)中搅拌混合20秒，然后置入一磁场中10秒。然后在分析器(206)中对红血球已被去除了的混合物进行分析，就得到了图8A的散点图。该图表明L的计数值为29.4(1)，M为8.1(2)，G为62.4(3)。
同时，将同一混合物的另一部分同10μl已结合了对嗜中性白血球特异的抗体的磁性微球相混合，以在装置(190)中去除红血球和嗜中性白血球。混合物的混合过程进行30秒，然后把它在磁场中放置10秒。然后，分析器(194)对嗜中性白血球和红血球已被去除了的混合物进行分析得到图8B所示的散点图。该图表明L的计数值为73.5(1)，M为21.7(2)，E为3.4(3)，B为1.4(4)。比较器(198)对两组计数值进行比较，得出白血球的五个区别类型的计数值分别是L为29.4，M为8.0，N为60.8，E为1.2，B为0.6。再进行一次显微对照，得出的数值分别是L为29.4，M为5.0，N为65.0，E为1.0，而B值小于1.0。
图9A和9B表示与图8A和8B相似的白血球的五个区别类型例子的结果的散点图。用相应于图8A和8B的相同的步骤分析20μl的全血样，得到的散点9A表明各子群体的计数值是L计数值为35.4(1)，M为14.6(2)，G为50.0(3);散点9B表明L计数值为66.4(1)，M为25.0(2)，E为6.6(3)，B为2.0(4)。最后得出白血球五个区别类型的计数值为L为35.4，M为14.6，N为45.5，E为3.5和B为1.1。该组数据可以与显微计数数值L为36，M为11，N为49，E为3和B为1相比较。
图10A和10B表示与图8A、8B和9A、9B相似的白血球的五个区别类型例子的结果的散点图，不过此例中使用了溶剂。在这个例子中，把20μl的全血样与80μl的缓冲溶液以及240μl上面提到过的对红血球优选的溶剂相混合。混合物混合时间为6秒，然后向混合物中加入猝灭剂。确定时间周期很重要，因为混合物中遗留的未被猝灭的溶剂要经过大约10秒后会开始影响白血球的重要性质。对红血球已被去除了的混合物进行分析，就可以得到如图10A所示的散点图，该图表明了L的计数值为25.7(1)，M为9.6(2)，G为65.0(3)。
混合物的第二部分包括该全血样第二个20微升样品，使之与120μl的缓冲溶液及10μl已带有对嗜中性白血球特异的抗体的键合其上的磁性微球，经30秒混合后在一磁场中放置10秒。然后向嗜中性白血球已被去除了的混合物中加入对红血球优选的溶剂，并在猝灭前混合6秒。得到的散点图10B表明L的百分计数值为74.6(1)，M为21.6(2)，E为2.9(3)，B为0.8(4)。最后得出白血球的五个区别类型的百分计数值为L为25.6，M为9.6，N为63.5，E为1.06，和B为0.3。此外，显微对比结果表明L的计数值为29.4，M为5.0，N为65.0，E为1.0，B小于1。
图11A和11B表示与图10A和10B相似的白血球的五个区别类型的散点图结果的另一个例子。把一全血样品分成两个样品，用相应于图10A和10B的相同步骤对它们同时进行分析。图11A的散点图表明L计数值为31.9(1)，M为17.6(2)，G为50.4(3)。图11B的散点图表明L计数值为67.1(1)，M为24.1(2)，E为7.6(3)，B为1.2(4)。所得的白血球的五个区别类型结果的计数值分别为L为31.9，M为11.4，N为46.0，E为3.6和B为0.7。与之相比，显微计数值为L为36，M为11，N为49，E为3，B为1。
在图12中，一般用(292)表示原申请中有关一种细胞群体分析方法和装置的一个进一步的实施例。分析仪(292)包括一生物样品(294)，该样品又包括至少一第一组活的生物细胞，必要时还包括一种缓冲溶液。
样品(294)通过管路(296)同来自管路(300)的至少一种试剂(298)相混合。在分析仪(292)中的功能性装置(302)中，按一定顺序或同时地去除红血球，并使嗜中性白血球移位。用(304)表示去除红血球的功能，用(306)表示移动嗜中性白血球或称使之移位的功能，由此表明上述过程是同时地或按顺序地进行的。红血球的去除可以如上所述，用磁铁(或磁场)或用溶剂或者把二者组合起来的方式来完成。去除嗜中性白血球或使之移位是通过向混合物中加入具有对已键合了对嗜中性白血球特异的抗体的微球来实现的。
一旦红血球已被去除，嗜中细胞发生移动或移位，将得到的混合物通过管路(308)送入分析器(310)。在这种情况下，嗜中性白血球距嗜曙红细胞和嗜碱细胞类型移位足够远，于是就直接得到了白细胞的五个区别类型M、L、E、B和N。分析器(292)的功能可以由装置(56)和(210)中的任何一个或由其变型来执行。
图13为由分析器(292)直接得出白血球的五个区别类型的一个例子的散点结果示意图。在这个例子中，生物样品(294)为10μl的全血样，试剂(298)为10μl已键合有对嗜中性白血球特异的抗体的非磁性微球同100微升缓冲溶液相混合，并在分装置(306)中混合了30秒后得到的混合物。再向所在的混合物中加入10μl对红血球优选的溶剂，在分装置(304)中混合6秒，然后向其中加入猝灭剂。然后分析器(310)对红血球已被去除、嗜中性白血球已经移位了的混合物进行分析，得到图13所示的散点图。该图给出直接计数值L为29.6，M为13.6，N为52.2，E为3.4和B为1.6。与之相比，显微计数法却只得出L为35，M为5，N为56，E为4，无B值。在这个特定的例子中，该全血样同时由Coulter Electronics，Inc.生产的一台通用的细胞计数仪进行分析，得到的计数值为L为29，M为11.1以及G为59.9(G中包括了N.E和B)。
参照图14-26D，图14-26D为申请号285856的第二个原申请的实施例示意图。
图14中，一般用(320)来代表第二个原申请中有关一种白血球群体子群体分析方法和装置的第一个实施例。分析仪(320)中包括在全血样中或来自一全血样的生物样品(322)，样品中含有至少一个第一组活的生物细胞(图中未示出)，包括至少一个白血球群体，该群体又具有至少一个可限定的子群体。用于此处的白血球子群体为那些能被特定的单克隆抗体结合的一白血球群体的子群体。世界卫生组织(Wold Heath Organization)和国际免疫学会(International Immunology Society)现已对单克隆抗体制订了一个命名法，对单克隆抗体根据分化群(CD)命名法来命名。该命名法对每一种细胞或细胞群体规定了一个特殊的特异性，对该CD群限定了一个对之特异的单克隆抗体。仅对本例子所涉及的用途而言，在下列各例子中采用了四种CD群CD4，CD8，CD2和CD20。表1列举了一些单克隆抗体的CD名称、特异性和一些商品来源。
表1分化群(CD) 抗体(商品来源)b特异性CD2(gp50)aT11(Coulter) E Rossette受体OK T11(Ortho);
Leu5a(BD)CD4(gp56) T4(Coulter) 助剂/诱导剂OK T4a(Ortho);
Leu3a(BD)CD8(gp32-33) T8(Coulter) 细胞毒/抑制剂TOK T8(Orther);
Leu2a(BD)CD20(gp35) Bl(Coulter) 除血浆细胞、BLeu 16(BD) 细胞瘤、骨髓瘤细胞和一些非T全细胞以外的所有的B细胞。
agp-以千道尔顿为单位的糖蛋白分子质量;
b Coulter-Coulter集团的Coulter免疫分部(在弗罗里达州的Hialeah)BD-Becton-Dickinson免疫细胞计系统Ortho-Ortho诊断系统(在新泽西州的Rariton)
生物样品(322)的细胞将参与一定量和/或定性分析或测定的生物反应。样品(322)可包括一缓冲溶液，细胞就加入到该溶液中。
样品(322)通过管路(324)同来自管路(328)的至少一种试剂(326)相混合。分析仪(320)中由一个根据功能命名的红血球分离和白血球子群体偏移装置(330)，把红血球从混合物中去除，并且把至少一个白血球子群体的至少一个特征值按一定顺序或同时地改变或者使之偏移。同第一个原申请所述的情况一样，装置(330)从混合物中去除红血球的方式有多种，比如所述装置(20)功能时所列举的那些方式。在混合物的同一部分中，至少有一个白血球子群体被同时地或按顺序结合在具有对该子群体特异的单克隆抗体的白血球微球上，由此改善(改变或称偏移)了所得到的细胞的混浊度和/或体积参数。
然后将红血球已被去除、白血球子群体已发生偏移的混合物经管路(34)送入分析器(332)中。分析器(332)与分析器(22)基本相同。有关的白血球子群体一般叙述为有关白血球群体的百分率。这样分析仪(320)能对一白血球群体的一个选定的子群体的至少一个特征值直接进行快速分析。分析仪(320)可以用在被偏移的白血球子群体未被数目更多的其它细胞所遮掩的场合，或者虽被遮掩，但由于白血球子群体的这些被偏移的细胞的数量占了总数中相当大的比例，因而能够将这些细胞辨认出来的那些场合。
在图15中，一般用(340)来代表第二个原申请中有关一种白血球群体子群体分析方法和装置的第二个实施例。分析仪(340)中包括一全血样中或来自一全血样的生物样品，样品中含有至少一个第一组活的生物细胞(图中未示出)，包括至少一个白血球群体，该群体又具有至少一个子群体。再使生物样品(342)的细胞参加一定量和/或定性测定或分析的生物反应。样品(342)可包括一缓冲溶液，细胞就加入到该溶液中。
样品(342)经过管路(344)与来自管路(348)的至少一种试剂(346)结合。分析仪(340)中由一根据功能命名的红血球分离和白血球子群体偏移装置(350)把红血球从混合物中去除，并且按一定顺序或同时地改变至少一个白血球子群体的至少一个特征值或使之偏移。如前所述，装置(350)从混合物中去除红血球的方式有多种，比如叙述装置(20)功能时所列举的那些方式。在混合物的同一部分中，至少有一个白血球子群体被同时地或按顺序键合在微球上，由此改善(改变或称偏移)了所得到的细胞的混浊度和/或体积参数。
同时，(或者按照一定顺序)，将至少一个白血球群体或子群体从混合物中除去。除去白血球群体或子群体的目的在于使有关的白血球子群体不至被这个群体遮蔽。白血球群体的去除过程可优先考虑用磁力法在白血球群体与磁性微球(包括一键合在微球上、对白血球群体特异的单克隆抗体)键合后来完成。
然后将红血球和白血球群体已被除去、白血球子群体已经偏离的混合物经管路(354)送入分析器(352)。分析器(352)也与分析器(22)基本相同。
图16中，用(360)代表第二个原申请中一分析装置的一个特殊的实施例，该实施例能够施行第一分析仪(320)和第二分析仪(340)所采用的方法。
仪器(360)与仪器(56)类似，其中只示出了一种特殊的计数方式，不过可以根据第一原申请的原理对其中的细节做出多不胜举的变化。此外，图中只详细指出仪器(360)的功能，而该装置的结构却可以用多种方式构成。
仪器(360)包括一吸入泵机构(362)，用该泵把有关的生物样品如样品(322)和(342)吸入仪器(360)中。吸入泵(362)经管路(364)与取样阀(366)相连，该阀又与样品探头(368)相连。溶剂泵(370)包括了溶剂(如试剂(326)或(346)的一部分)，并通过管路(372)与阀(366)相连。需要时阀(366)和泵(362)能把生物样品(322)或(342)以及来自泵(370)的溶剂一同吸入。不过，最好生物样品(322)或(342)与溶剂分开加入。
然后把试剂混合物或生物样品本身经输料管路(374)送入混合装置(376)中。混合装置(376)包括一混合容器(378)，样品或试剂就被送入该容器，分析仪(320)和(340)的工作过程仅有细微的差别，下面一同叙述这两部件。
装置工作时，如果红血球已被来自泵(370)的溶剂溶解，那么当反应结束时，将从装置(380)经管路(382)而来的猝灭剂或固定剂加入混合物，去除红血球的反应就完成了。也可象叙述(384)功能那样在容器(378)中混合溶剂和样品，以促进反应的进行。
去除红血球之前(或之后，或在此过程中)，白血球发生偏移。在分析仪(340)中，一个白血球群体或子群体也被除去。白血球子群体的偏移是通过将来自装置(386)的特殊的白血球微球经管路(388)、阀(390)和容器管路(392)加入容器中而进行的。混合机构(384)将白血球微球同混合物或样品进行混合。
用在此处的混合装置(376)的结构与混合装置(70)基本相同。反应速度因采用混合装置(376)而大大提高，同时有关细胞的性能并设象提高反应温度造成的那样被明显地破坏。此外，反应通常在几分钟之内就能完成，反应时间一般为两分钟或更短。这就使自动的大容量分析装置(360)能进行快速分析。
然后在分析器(320)中，用猝灭剂(如来自装置(20))猝灭已除去红血球和修改了的白血球子群体的反应剂经管路(394)送入分析器(396)(即分析器322)中。根据Wallace H.Coulter在美国专利US2656508中公开的计数和粒度测量技术，可以把分析器(396)做成许多类型，该类分析器现已用在专利受让人Coulter Elctronics，Inc.所生产的许多种商用的血球计数器中。
如前所述，分析器(396)一般包括一个流动传感器或检测容器(398)。容器(398)包括一个传感器(400)，其中有一个通孔(402)。容器(398)中有一第一部分(404)，其中有一第一电极(406)直接与其中的流体接触。
容器中第一部分(404)和电极(406)通过孔(402)与容器的第二部分(408)相通，(408)中有一第二电极(410)。电极(406)和(410)通过反应线(412)和(414)与一射频/直流源和检测电路(416)相连。电路(416)与电极(406)和(410)之间的一个直流、低频电流或信号或者一个高频信号相连。
可以用该低频信号来检测细胞通过孔(402)产生的信号脉冲的幅度，用该高频信号得到同一细胞通过孔(402)时产生的浑浊(opacity)度电信号。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hoff在美国专利US3502974以及受让人Coulter电子公司所持有的之后的几份专利及几篇文章中公开了测量细胞浑浊度电信号的方法。申请号为921654的专利申请公开了一种可用于此处的特殊电路，该申请可供此处参考。
把电路(416)检测出的由被测细胞产生的信号通过一直流信号线(418)和一射频信号线(420)送入一与比较器(26)相似的比较器(422)中。
分析器(396)包括一阳极(Sheath)流动装置，该装置能用公知的方式把细胞聚集在检测器(398)中。该阳极流可由一射流系统(424)来提供，该系统通过两条线(426)和(428)以公知方式与检测器(398)相连。样品反应混合物可经引导管(430)进入检测器(398)中，并可由检测器(398)经排液管(432)进入废液容器(434)中。
每次测试完成以后，混合器(378)都用来自冲洗管路(436)的液体清洗或喷淋，废液经废液管路(438)排出。一旦清洗完容器(378)，就以把另一个样品或样品的其它部分送入仪器(360)。
在分析仪(340)中，工作过程与分析仪(320)基本相同，不同之处只是加入了白血球群体或子群体磁性微球。在混合过程中或混合后就可以用磁场或磁铁(440)把已键合在微球上的白血球子群体除去。具体地说，可以用电磁铁装置或用使磁铁(440)相对于容器(378)做机械运动的方式形成该磁场，以捕获键合在磁球上的白血球子群体。然后用上述的方法把已去除了键合在磁珠上的白血球子群体的混合物经管路(394)送入一与分析仪(320)相似的分析器(396)中，以获得分析结果。
然后清洗仪器(360)，使之准备接受用于下次分析的下一个样品，可以用探头冲淋机构(442)清洗探头(368)，各管路和容器(378)也可用常用的方法进行清洗。随后的样品混合物每次分析以一个快速和自动方式获得，样品混合物的分析之周期约为五分钟或更短。
如果不采用溶剂方案，那么在分析仪(320)和(340)的任一个中可以不采用任何溶剂把样品(322)或(342)经阀(366)送入混合器(376)中。在这种情况下可以用来自红血球微球装置(444)的已键合了对红血球特异的抗体的微球，用磁力将红血球除去，然后把混合物经管路(446)送至阀(390)，再经管路(392)送入容器(376)中。虽然没有用溶剂，仍然可在混合后用磁铁(440)将结合在磁性微球上的红血球除去。去除方式与上述的用磁力法除去结合在微球上的白血球的方式基本相同。
此外，还有一种提高反应速度或反应效率的方法，即把样品的反应混合物与红血球溶剂及红血球磁球的混合物一起使用，可以象上述方式那样，混合反应混合物，用猝灭剂猝灭，用磁力法除去与微球键合的红血球，然后对白血球进行分析。
图17A和17B示出了采用与仪器(360)相似的一种原型分析仪从一全血样中得到的散点图中两组结果，其中去除了两个白血球群体并直接对T8子群体进行分析。T8子群体是带有受体或抗原的细胞或生物体，对T8特异的抗体就结合在受体或抗原上。图中用T+8代表这些细胞或生物体，而那些没有携带受体或抗原(对T8特异的抗体就结合在这些受体和抗原上)的细胞或生物体则用T-8来表示。在这些例子中，生物介质(342)是用混合器(376)混合的20微升全血样品。在图17A和17B两图中，将20微升的全血样(即介质(342))与40微升已键合了对红血球特异的抗体的磁性微球相混合，再与120微升缓冲溶液及10微升已键合了对嗜中性白血球和嗜曙红细胞特异的抗体的磁性微球相混合，再与30微升缓冲溶液相混合，这样就制成了试剂(346)。申请号为068618，申请日为1987年6月3日，名称为“对嗜中性白血球和嗜曙红细胞的一个共同的测定位置特异的单克隆抗体”的美国专利申请中公开了对嗜中性白血球和嗜曙红细胞特异的抗体的一个典型的例子，该申请可作参考。
适用的磁性微球可有许多种，在本例中用的是Seradyn.Inc.of Indianapolis，Indiana出售的直径为0.7微米，重量体积比为10%的固体聚苯乙烯磁性微球。然后将反应混合物在混合器(376)中混合10秒，再在磁铁(440)的磁场中放置15秒，然后用分析器(396)对得到的除去了红血球、嗜曙红细胞和嗜中性白血球的混合物进行分析。图17A就是得到的散点图A。
采用同样的步骤，向12.5微升的缓冲溶液中加入12.5微升已键合了对T8特异的抗体的非磁性微球，得到试剂(346)。图17B的散点图就是用该试剂(346)得到的。T8特异的抗体是Coulter Immunology Division of CoulterCorporation以商标COUTER CLONE出售的。适用的非磁性微球也有许多种，在本例中用的是直径为1.78微米，重量体积比为8%的固态表面活性剂单硫酸酯聚苯乙烯乳胶微球(Surfactant free sulfated polystyrenelatex microspheres)，是由Interfacial Dynamics of portland Oregon出售IDC微球。
加入T8微球使键合的CD8细胞移位区域B，通过比较图17A和17B的散点图可以看到它们已经彼此分开，可以对它们进行鉴别和计数。在图17A中CD8细胞淹没在剩余的白血球中。在图17B中，已将嗜中性白血球和嗜曙红细胞从散点图中除去，否则它们会遮蔽对移位的CD8细胞的鉴别。图17A表示了嗜中性白血球和嗜曙红细胞的去除过程，而图17B接着清楚地表明CD8键合细胞正从A区移向B区。此处的缓冲溶液可以用Sigma Chemical Company of st.Louis，Missouri出售的磷酸盐缓冲溶液。
图18A是进一步表明用分析器(352)得到的单核细胞(M)、淋巴细胞(L)和粒性白血球(G)群体位置的常规的散点图或称三参数矩形图。正如从图17B所见的那样，由于没有除去粒性白血球，代表移位的白血球子群体的B区被数量大得多的粒性白血球遮蔽住。图18B是嗜曙红细胞和嗜中性白血球。去除后剩余的单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性细胞白血球群体的散点示意图。虽然嗜碱细胞仍然会部分地遮蔽有关区域，但由于它们的数量(百分率)只占白血球群体的很小的一部分，因此不会明显影响所需要的子群体的计算结果(即百分率)。不过，如果需要也可把嗜碱性细胞的影响从子群体百分率中扣除掉。
图19A-D、20A-D、21A-D是对从三个不同患者身上分别抽取的血样的CD2、CD4、CD8和CD20白血球子群体直接子群体分析所得结果的示意图。就每个子群体的情况而言，将28微升全血样品同20微升键合有对嗜中性白血球和嗜曙红细胞特异的抗体的磁性微球(重量体积比为2.5%)相混合。此外，也将键合有相应的单克隆抗体、用于相应的白血球子群体的非磁性微球同样品相混合。分别被T4、T8、T11或B1细胞涂覆的各种微球的量都是40微升(单位体积的每种溶液中微球重量都是1%)。分别将每种成份齐全的混合物(如带有T8的N和E微球)同一磷酸盐缓冲溶液(即PH为7.2到7.4的1%的牛血清蛋白)相混合，配成总体积为150微升的溶液。分别把每种混合物在容器(378)中用混合器(376)混合2分钟，再放入磁场(440)中1分钟。在这些例子中，按顺序用上面提到的溶剂除去红血球。过程是，先加入白血球微球，然后用来自溶剂源(370)的300微升的溶剂溶解去除红血球。所用的溶剂可以是Coulter电子公司出售的Erythrolyse溶解试剂。然后用来自源(380)的120微升猝灭剂(如还是Coulter电子公司出售的一种白血球保护剂Stabilyse)猝灭该混合物，再将此混合物送入分析器(396)进行分析。
每个散点图中右侧的框(1)分别代表有关白血球子群体。图中所示的框1、2、3等看上去(或者自然而然地)都与有关白血球群体或子群体相适应。
用通用的血球计数器对这些结果进行比较。下面就给出了用本发明的方法(移位法SHIET)与流动血球计数器法(CYT)对三个样品所作的用百分率表示的比较结果。
T4(图19A) T8(图19B) T11(图19C) B1(图19D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样 51 52 18 22 82 76 15 13品1，T4(图20A) T8(图20B) T11(图20C) B1(图20D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样 53 54 32 29 89 83 6.5 7.00品2，T4(图21A) T8(图21B) T11(图21C) B1(图21D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样 46 46 24 18 86 81 11 10品3，图22A也示出了分析器352得到的M、L和G细胞群体正常散点图或称3参数位置图。没有去除N和E时，CD4细胞被这些细胞群体遮蔽住。如图22B所示，用对N和E特异的单克隆抗体微球把N和E移至区域1(即框1)，CD4群体看上去也被移至区域2(框2)，在图22A中该区域被N和E所遮住。在该例子中，对应于图22C，将28微升全血样品与50微升直径为2.2微米的微球(微球上键合了对N和E特异的单克隆抗体)，以及50微升键合有对T4特异的单克隆抗体的微球和22微升稀释剂相混合。图22B除没有T4微球和稀释剂为72微升外与图22C基本相同，图22A除没有任何微球和稀释剂为122微升外也与图22C相同。
图23A-D示意了采用大量与有关的白血球子群体相键合的微球对白血球进行直接分析的情况。图23A和23B分别是用0.8微米非磁性微球使带有T4白血球子群体和T11白血球子群体的L群体的每个发生移位散点图。从图23A和23B中可以看出，这个白血球群体偏移量还不够大，还无法区分各白血球子群体。图23C、23D都是具有T4和T11白血球子群体L群体的散点图，其中分别用0.8微米和2.2微米同T4白血球子群体和T11白血球子群体相键合的方式使T4白血球子群体和T11白血球子群体发生偏移。通过使山羊抗鼠IgG抗体附着在2.2微米微球上方式使0.8微米微球结合在2.2微米微球上，该山羊抗鼠IgG抗体与T4或T11抗体相结合，并通过它与0.8微米微球结合。
图24A-C表示与有关的白血球子群体结合的非磁性微球粒度大小的影响。在这个例子中，将28微升全血样品同10微升键合有对N和E特异的抗体的磁性微球(单位体积溶液中微球重2.5%)和40微升键合有对T8特异的抗体的非磁性微球(单位体积溶液中微球重1%)相混合。所用的T8微球有两种大小，以表明其对散点图中群体偏移的影响。再加入一种缓冲溶液，配成150微升体积的混合物，将混合物搅拌混合2分钟，再在磁场中放置1分钟。将所得到的N和E已被去除了的混合物用溶剂进行溶解，以去除红血球，然后进行分析。图24A中有一未附着在微球上的对照白血球子群体，一个键合在2.2微米非磁性微球上的T8白血球子群体，以及一个键合在3.0微米非磁性微球上的T8白血球子群体。图中所标的宽度和高度表示探测信号的标准偏差。图24B是表明3.0微米微球与T8白血球子群体键合造成T8偏移的一个散点示意图，而图24C是表明2.2微米微球与T8白血球子群体键合造成T8偏移的一个散点示意图。对不同的微球，分析得出的T8白血球子群体的百分率分别是20.9和19.3。图24B表明，较大的微球明显地产生一更为清晰的散点分布。
图25A-D表示根据第二个原申请对两个白血球子群体同时进行直接分析的情况。在这个例子中，把28微升全血样品同10微升键合有对N和E特异的抗体的磁性微球、52微升缓冲溶液和40微升键合有对T8特异的抗体的3微米非磁性微球相混合，然后搅拌混合2分钟。再把此混合物在磁场中放置1分钟，然后用溶剂溶解得到的N和E已被除去的混合物以去除红血球，再对混合物进行分析。图25A中有一未附着在微球上的对照白血球子群体样品，一个键合在2.2微米非磁性微球上的T4子群体的读数，一个键合在3.0微米非磁性微球上的T8子群体的读数，该图表明两个偏移了的白血球子群体已经分离。图25B为键合在2.2微米微球上的T4白血球子群体偏移至区域A的散点分析图，图25C为键合在3.0微米微球上的T8白血球子群体偏移至区域B的散点分析图。图25D为T4和T8白血球子群体偏移至各自的区域A和B的散点分析图，这样就可以对T4和T8子群体进行同时分析。
图26A-D四个不同的散点图用不同的参数示出了L、M和G三个群体。虽然前面的例子只用浑浊度比DC(RF/DC)来描述，但实际上可用任何两个不同的参数来构成散点图。图26A表示只用RF/DC构成的散点图，图26B则用了浑浊度/RF，图26C用浑浊度/(DC-RF)，图26D则用前述的浑浊度/DC。此外，虽然采用的是DC/RF或RF/DC，但只要两信号能彼此分开，由于两信号的频谱位置和/或相位的不同，采用任何两个频率都行。浑浊度是一个优选的参数，因为它是射频信号的归一化形式。正如图26A-D所清楚表明的那样，可以根据需要改变数据的图象。DC是所检测的细胞或生物体体积的函数，而RF是所检测的细胞或生物体的内导和体积的函数。
图27-46示出了本发明的实施例。
在图27中，一般用500来表示对细胞(如具有多个区别类型的细胞)进行分类的方法和装置的第一个实施例。装置或分析仪(500)包括一生物样品(502)，该样品含有至少一个第一组活的生物细胞(图中未示出)，包括一全血样品中或来自一全血样的至少两个白血球群体。
生物样品(502)的细胞将参加一定量和/或定性测定或分析的生物反应。生物样品(502)可包括一缓冲溶液，细胞就加入到该溶液中。
生物样品(502)经管路(504)同来自管路(508)的至少一种试剂(506)混合。在分析仪(500)的一红血球分离装置(510)中，红血球从混合物中分离出。和第一个原申请的情况一样，从装置(510)中去除红血球的方式可以有许多种，如装置(20)所列举的。
将分离出红血球后的混合物第一部分经一个管路(514)输送白血球分析器(512)。这样就获得一个对生物样品(502)的总的或整个群体标准或对照手段。分析器(512)可以是和分析器(86)相同的分析器，也可以是一个光敏分析器，例如在1987年3月13日申请的申请号为No25442的以及在1987年12月4日申请的申请号为No129954的名称为“由几部分组成的利用光的散射技术的差动分析仪器”的申请，这两份专利申请文件包括在参考文件里。这个单独的检测参量可以是电子学的，例如射频或直流信号，也可以是光信号，例如中间角度(median angle)的光散射或者任何其它所希望的光参量。
将混合物的第二部分经管路(518)输送到N分离装置(516)，通过加入上面键合有特定N抗体的适宜的磁性微球的方法将N分离出，在这个例子中所用的特定N抗体是在1986年12月8日申请的原申请号为No168306，现申请申请号为No938864的名称为“单克隆抗体对嗜中性血球的测定”，这篇文件包括在参考文件中。为了把磁键合的细胞从混合物中分离出去，如前所述，可以利用磁铁或磁场，将分离出N后的剩余的混合物经管路(520)，输送到分析器(512)。然后将对这部分混合物分析的结果在比较器(522)中同第一部分混合物的分析结果相比较，从而得到在生物样品(502)中N的百分率。
将第三部分混合物经管路(526)输送到N和E分离器(524)，通过把上面键合有N和E特定抗体的合适的微型磁球加入的方法，在1987年6月3日申请的申请号为No068618、名称为“单克隆抗体对嗜中性白血球和嗜曙红细胞的共同决定子部位的专一性的专利申请描述了这样的N和E特定抗体的例子，这篇专利申请文件也包括在参考文件中。分离的键合在同一的或分离的磁性微球上的N和E特定的抗体还可以在适当的地方或研制的场合下应用。将分离出Ns和Es后的剩余混合物经管路(528)输送到分析器(512)，将这部分混合物的分析结果在比较器(522)中与第一部分和第二部分混合物的结果相比较，从而获得Es和Ms在生物样品(520)中的百分率。
将第四部分混合物经管路(532)输送到L和N分离装置(530)，通过把上面键合有L和N特定抗体的适当磁性微球加入的方法去掉L和N，其中的N特定抗体可以是上述参考文件中的N特定抗体，也可以是其它适合的抗体，其中的L特定抗体可以是研制的L特异性抗体或者是由Coulter公司Coulter免疫学分部销售的名称为T11和2H4特异抗体的组合物，这两种特异抗体把所有的L结合在一起。将分离出L和N后的剩余的混合物经管路(534)输送到分析器(512)，然后可以把对这部分混合物的分析结果同其它各部分混合物的结果相比较，从而获得到B和L在生物样品(502)中的百比率。
这样，分析仪(500)完成了细胞的单一分类，例如N利用管路即通道(514)和(518)，E和/或N和/或M利用管路(514)、(518)和(526)，而全部五部分的白血球的区分利用所有的四个管路。分析仪器500)的一个最重要的特性是只用单个的分析参量就可分析混合物，例如这个参量可以是一个电参量，也可以是一个光的参数。其它的组合可以利用，但是在每种情况下只用单一的检测的参量或特性是为完成本发明的分类所必需的。
图28说明了一个把方法和装置分析仪(500)结合在一起的分析仪器的实施例，由总的代号(540)来代表这个仪器。这个仪器(540)包括吸气泵机构(542)，它用于将感兴趣的生物样品(例如样品502)抽到仪器(540)中，这个吸气泵机构(542)经管路(544)连接到与取样器(548)相连接取样阀(546)上。生物样品(502)经管路(550)和多通阀(551)输送到分开的通道(514)、(518)、(526)和(532)中。
现在来描述第一通道(514)，样品部分被输送到容器(552)中，这个容器可以是一个混合容器，为了除去红血球将样品和试剂输送到该舱中。例如利用溶剂(lyse)，通过把适合的溶剂加到红血球上，使红血球在容器(552)中溶解，最好使红血球和溶剂搅拌混合，在反应完成后，把猝灭剂或固定剂送到容器(552)。
在这里可以利用的适合的混合装置的具体细节已由1987年3月13日申请的申请号No25337，名称为“用于促进生物反应的小体积快速混合的方法和装置”中所表述，这篇专利申请包括在参考文件中。通过利用混合器，使反应速度大大加快，而对细胞的重要的性质并没有明显的损害，例如在可能引起反应温度升高的情况下也能这样。而且这个反应通常是在比一分钟小得多的时间内完成的，通常是在15秒或更短的时间内完成，这样，就能使大容积分析仪器(540)进行自动快速分析。
溶解去掉红血球后的猝灭的反应混合物经过管路(554)输送到多通阀(556)，或者直接经管路(560)输送到白血球分析器(558)中。分析器(558)根据计数和测定大小的技术的不同可以有得多种物理上的型号，这些技术由Wollance.H.Coulter在美国专利No 2656508中，这份专利是关于作为包括在一些商品化的血液细胞计数量中的利用光或电子检测技术的，这个产品的受让人是Coulter.Electronics Inc.。
分析器(558)一般包括一个流量检测器即检测容器(562)，容器(562)包括一个具有通孔的传感器(564)，容器(562)包括装有与容器的流体相接触的第一电极(568)的第一部分(566)，容器的部分(566)和电极(568)可以经检测孔和在里面装有第二电极(572)的容器的第二部分(570)相连通。
电极(568)和(572)经电抗性的导线与射频/直流电源和检测电路(574)相连接。电路(574)可以连接在电极(568)和(572)之间的直流、或低频电流(或信号)，也可又连接高频信号。
这个低频信号用于检测被通过检测孔的细胞所产生的脉冲信号的大小，这个高频信号同样可以用作单一参量或者和低频信号一起，以便获得通过检测孔的同一细胞的光浑浊度。
细胞光浑浊度测量方法由Wallace H.Coulter和Walter.R.Hogg在美国专利No3502974和其后的几篇专利以及受让人Coulter.Electronics Inc的出版物中所公开。在这里可以利用的一个具体电路由原申请号168008名称为“用于测量颗粒的抗体和反应性的粒子分析器”中所公开，这篇申请是在1986年10月21日申请的申请号为No 921654，，现在被批准的美国专利号为No 4791355的后续申请，它也包括在参考文件中。
由电路(574)根据检测的细胞产生的信号经一个直流信号线(576)和/或射频信号线(578)馈送到比较器(580)(类似于比较器26)中，这个比较器(580)可以存储由第一部分混合物(即没有红血球群体或减去子群体)产生的信号，以便同从后序的几个部分混合物得到的结果相比较，这将在后面描述。
分析器(558)可以包括在检测器(562)中一个阳极(Sheath)流集中细胞，这是公知的技术。这个阳极流可以由一个射流系统(582)来提供，该射流系统用公知的技术同检测器相配合。分析器(558)已经对结合射频和直流分析电路做了说明，这仅作为一个例子。为了获得本发明的几个部分的白血球群体或子群体的特性，仅需要利用单一的检测参量(电的或光的)在电检测的情况下，这个参量可以是直流也可以是射频信号;利用光学检测时(未描述)，也只用单一的参量，例如需要用一个中间角度光散射。这样一维检测简化了仪器(540)的结构，还可降低仪器的成本。
样品混合物的第二部分通过阀(551)经管路(518)输送到N分离装置(516)，分离装置(516)包括一个混合器或容器(584)，混合容器(584)经管路(518)把第二部分混合物输送到那里。混合器(584)可以包括上述的所有任选部件例如包括一个为供红血球溶解的溶剂输入管路。
如使用细胞溶解溶剂，在(586)中完成混合之后(其功能已经说明)、经过猝灭管路提供猝灭剂，同时或者相继经管路(590)从微型球源(588)向容器(584)供给微球，借助这些上面结合有特异抗体的适合的磁性微球将N分离出去，然后利用磁铁(592)或磁场分离出靠磁力结合在微型磁球上的细胞，然后混合和猝灭后的混合物经管路(520)通过阀(556)和管路(560)输送到白血球分析器(558)按如前所述的方法进行分析。去掉N后的分析过的混合物的结果在比较器(580)中被比较，从而测定出在样品(502)中的N的百分率。
样品(502)的第三部分混合物经管路(550)和阀(551)，再经管路(526)输送到N和E的分离装置(524)中，分离装置(524)包括一个混合容器(594)。在这第三部分混合物中，用红血球细胞溶剂去掉红血球，然后送到容器(594)，在该溶剂和样品部分混合后，再经猝灭管路进行猝灭，N和E被键合有N和E特异抗体的磁性微球或结合在微型磁球上的抗体分离出，这些微球经管路(598)由微球源输送到容器(594)中。这些微球在(600)中完成混合过程，然后这些结合有N和E的微球在(602)中被分离出。被分离出N和E后的混合物经管路(528)输送到阀(556)，然后经管路(560)输送到分析器(558)中，以便获得上面提及的结果。
这个仪器可以利用前两个通道(514)和(518)测定N的百分率，或者根据需要利用前三个通道(514)、(518)和(526)获得N和E的百分率和/或M的百分率。为了进一步获得白血球群体或子集群体的特征值，可将样品混合物(502)的第四部分经管路(550)和阀(551)，再经管路(532)输送到L和N分离装置(530)，并且通过例如在容器(604)中溶解的方法将红血球分离出去，而L和N则通过把L和N键合到有L和N的特异抗体的微型磁球或结合有特异抗体的微型磁球上来分离出L和N，这些磁性微球是经管路(608)从微球源(606)输送到混合容器(604)中的。这些微球在(610)中完成混合，接着在(612)中将靠磁力结合L和N的微球被磁场分离出。
分离出L和N的混合物经管路(534)输送到阀(556)，再经管路(560)输送到分析器(558)，以便获得上面提及的结果。利用其它几个通道的组合，可以获得L和/或B的百分率，这样达到完成确定完整的五部分的白血球的数量上区别程度，从而获得了N、E、M、L和B的百分率。混合器包括适合的冲洗管路和废物排放管路，仪器(540)可以包括一个取样管的冲洗管(614)，以便在抽取下一个分析的样品或下一个样品部分之前清洗仪器(540)。此外，根据需要样品(502)可以经管路(618)从源稀释。
结合在方法和分析器(500)装置里的唯一的一个管路系统实施例已经描述过了，但是，本专利申请中的类似实施例可以根据各种方案进行补充，例如分析仪器(540)可以在许多布置中实现。例如，分析器(540)可以包括一个单通道，象通道(518)，而样品的每一部分可以顺序地通过分离装置(516)，以便使相应的一个白血球群体或几个群体从每一个部分样品中分离出，这正如前面对这些分离通道所描述的那样。
现在参看附图29A-D和附图30A-D，图中示出了两组一维散射谱的由几部分组成的特征值结果，这个结果是从一个全血液样品中获得的，是对类似于分析仪器(540)采用标准分析的方法而完成的试验，在每种情况下生物样品为28微升全血液样品，对于在第一通道(514)使用的部分样品，该样品同122μl缓冲液相混合，这部分样品用300μl红血球最合适的细胞溶剂溶解(见上面在容器(552)的引证)，这部分样品被溶解4秒种，然后在经管路(554)、阀(556)和管路(560)输送到分析器(558)之前用120μl猝灭剂猝灭。在图29和30中示出了了利用一维电检测参量的分析结果，为获得图29A-29D中的数据采用的是直流信号，为获得图30A-30D中的数据(为比较用)采用的射频信号，其中所用的试样是同一个样品部分，测量是在同样的时间内在分析器(558)中完成的。在图29A中得到两个明显的的可区分的数据峰(620)和(622)，在图30A中得到两个明显可区分的数据峰(624)和(626)，峰(620)和(624)表示样品中的L和B的百分率;峰(622)和(626)代表了样品中的N，E和M的百分率。显然在一维的条件下，不需要处理，这些单个的百分率在同一数据峰里被竞争的细胞所掩蔽，如上面参考的申请中所述，这至少在为了区分数据而用于大于某一个参量的场合下，对某些细胞来说没有问题的。
在第二通道(518)中，将28μl的全血样品部分同40μl上结合有N特异抗体的磁性微球相混合，然后在容器(584)中同82μl缓冲液相混合，将这部分样品混合搅拌60秒钟，再按通道(514)中采用的溶解和猝灭操作，再在分离出N后的混合物经管路(520)、阀(556)和管路(560)输送到分析器(558)之前将这部分样品放在磁场(592)中30秒钟。这个试验结果如图29B中的两个数据峰(628)和(630)所示，以及如图30B中的两个数据峰(632)和(634)所示，峰(628)和(632)和峰(620)和(624)分别仍是同一个峰，尽管它们在样品中的百分率现在比较大一些。另一方面峰(630)和(634)代表了分离出N后的E和M的百分率，数据峰(630)和(634)分别与数据峰(622)和(626)比较后，就测定出在全血样品中N的百分率。
紧接着，或任何包括基本上同时的顺序，第三部分28μl的样品被输送到第三通道(526)并同20μl的带有E和N的特异抗体的磁性微球或在上面结合有这二种抗体的磁性微球搅拌混合。然后，在(594)容器中同102μl的缓冲液相混合，这部分样品被搅拌混合30秒钟，然后按照和在通道(514)中相同的方式溶解和猝灭，再在这个分离出N和E后的混合物经管路(528)、阀(556)和管路(560)输送到分析器(558)之前，放在磁场(602)中30秒钟。在图29C中又得到两个数据峰(636)和(638)，在图30C中得到数据峰(640)和(642)，峰(636)和(640)和峰(620)和(624)分别对应同一成分结果。另一方面数据峰(638)和(642)在同数据峰(622)和(626)比较后代表了在全血样品中的M的百分率。再使数据峰(638)和(642)同数据峰(630)和(634)相比较，就可测定出E在全血样品中的百分率。
第四部分28μl样品被输送到第四通道(532)中同70μl的上面键合有CD2特定抗体磁性微球和50μl上面结合有CD45R的特定抗体的磁性微球在容器(604)中搅拌混合，这部分样品经搅拌混合2分钟，然后放在磁场(612)中30秒钟，将剩余的混合物经管路(646)转移到一个存储容器(644)中。这个存储容器看来是必需的，因为根据上述提到的名称T11和2H4和N特定的抗体所采用的特定抗体，在同时采用时可能会相互干扰。目前还不清楚这是由于这些特定抗体引起的，还是由细胞本身的性质引起的。一旦分离出结合有细胞的T11和2H4后的混合物输送到容器(644)后，就要用除去磁场来清洗容器(604)，以便清除上面结合有CD2和CD45R细胞群的微型磁性球。
然后，将结合N的磁性微球在容器(604)中分离，这些磁性微球可以由另外一个源(未示出)提供，而不是由源(606)提供的。这个分离操作是先将这些40μl的上面结合有N特定抗体的磁性微球保持在磁场(612)中，然后将缓冲液排放出去。另一方面这个混合物可能被调节，因而该缓冲液被作为混合物的一部分来利用，或者是利用磁性微球的浓缩的体积以及该溶液不需利用。然后，这部分样品从容器(644)经管路(648)返回容器(604)，同上面结合有N特定抗体的微型磁球搅拌混合，再按在通道(514)所述的方法溶解和猝灭，然后在分离出所有L和N后的混合物经管路(534)、阀(556)和管路(560)输送到分析器(558)之前，再次放在磁场中保持30秒钟，试验结果如图29D中两个数据峰(650)和(652)和图30D中的两个数据峰(654)和(656)所示。峰(650)和(654)仅代表B，因为L已经全部被分离出去。因为L约占正常的全血液样品的30%，所以，使原来在样品中占约19%的B增强一个非常明显的数据峰(即数据的总数)，因为N在以前就从峰(652)和(656)中分离开，而N原本占样品的60%，所以使B峰值进一步增强，因此，现在的B约占剩余的B、M和E细胞的10%。
实际计算百分率按下述方法进行用两个峰值(利用图29A-29D作为例子)的总的数据去除一个数据峰(该峰值的细胞计数)来计算出数据峰的细胞数目
1.)M%-从通道(526)测定的结果〔(峰1(620))(峰1(636))〕××峰2(638)2.)M+E%-从通道(518)测定的结果〔峰1(620)(峰1(628))〕××峰2(630)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝〔峰2(622)〕-M+E%5.)B%-从通道(532)测定的结果〔峰2(630)(峰2(652))〕××〔峰1(650)〕＝B1%B1%××〔(峰1(620))(峰2(628))〕＝B%6.)L%＝〔峰1(620)〕-B%根据在图29和30中所示出的数据，从射频和直流数据的计算结果在表Ⅱ中给出表Ⅱ通道 直流 射频峰1 峰2 峰1 峰2514 28.1 71.9 30.3 69.7518 74.4 25.6 74.1 25.9526 83.8 16.2 83.4 16.6532 10.9 90.1 10.0 90.0整个五个部分N、L、M、E和B的从直流和射频数据峰值计算出的百分率的差别也计算出来，为了验证的目的，把这些差别和光检测仪器的测定结果比较过，如在美国的No025442号申请中所叙述的。
表Ⅲ五部分的差别光 直流 射频N61.58 N62.2 N59.1L28.50 L26.9 L29.1M6.27 M5.4 M6.0E3.10 E4.3 E4.6B0.56 B1.2 B1.2现在参看图31A-D和图32A-D，这些图中示出了第二个两组一维由多部分特征结果所组成的散点图，该散点图是从第二组全血样品中测得的。在每种情况下的生物样品都是28μl全血样品，按照相应于图29和31的所述的每个通道予备的这个样品在容器(552)中的第一通道(514)中溶解猝灭，然后输送到分析器(558)，通过一维电参量检测获得的结果示在图31和32中。为了获得31A-31D中的数据采用的是直流信号，为了获得32A-32D中的数据(用于比较)采用射频，所用的是同一样品，并且是在同一时间在分析器(558)中测量的。在图31A出现两个明显可区分数据峰(658)和(660)，在图32A中出现数据峰(662)和(664)。峰(658)和(662)代表了L和B在样品中的百分率，峰(660)和(664)代表了N、E和M的百分率，同样是在一维没有进一步处理的情况下，单个的百分率被在同一数据峰的竞争细胞所掩蔽。
在第二通道(518)中，第二部分全血样品同上结合有N特定抗体的磁性微球在容器(584)中混合，搅拌溶解和猝灭，在分离出N后的混合物输送到分析器(558)之前放在磁场(592)中。在图31B中得到两个数据峰(666)和(668)，而在图32B中得到两个数据峰(670)和(672)。峰(666)和(670)和峰(568)和(662)是同一个峰，尽管在样品中它们的百分率是比较大的。另一方面峰值(668)和(672)代表了分离出N后的E和M的百分率，然后可以把数据峰(668)和(672)分别同数据峰(660)和(664)相比较，以便测定N在全血样品中的百分率。
下一个或在任何一个包括基本上同时的顺序中，第三部分样品输送到第三通道(526)中，然后容器(594)中同带有E和N特定抗体或上面结合有这两个抗体的磁性微球搅拌混合，溶解和猝灭后，在分离出N和E后的混合物后输送到分析器(558)之前放在磁场(602)中。结果在图31C又是两个数据峰(674)和(676)，在图32C中是两个数据峰(678)和(680)。峰(674)和(678)和峰(658)和(662)的作用是相同的，而数据峰(676)和(680)在同数据峰(660)和(664)比较以后代表了在全血样品中M的百分率。把数据峰(676)和(680)同数据峰(668)和(672)比较以后，可以确定出在全血样品中E的百分率。
第四部分样品被输送到第四通道(532)中，然后在容器(604)中同上面键合有CD2特定抗体的磁性微球和上面结合有CD45R特定抗体的磁性微球搅拌混合后，放在磁场(612)中，再将剩余的分离过的混合物输送到存储容器(644)。
将上面结合有N特定抗体的磁性微球保持在磁场(612)中，然后将缓冲液排出去，这样就完成了在容器(664)中对N结合的磁性微球的分离。在这部分样品经管路(648)从容器(644)清洗之后，返回到容器(604)，并同上面结合有N特定抗体的磁性微球搅拌混合，溶解和猝灭，接着在L和N全部分离出后的混合物输送到分析器(558)之前，这部分样品再放在磁场(612)中。结果是在图31D中得到两个数据峰(682)和(684)，而在图32D中得到两个数据峰(686)和(688)。峰(682)和(686)只代表B，因为全部的L已经分离出，从而使B增强为一个很明显的数据峰(即数据的总量)。B因为N在以前就被从峰(684)和(688)中除去，因此也从剩余的样品中分离出而得到增强。
实际的百分率的计算可根据下述方法(和以前相同)来完成，通过把数据峰(在峰中的细胞记数)被两个峰的总的数据去除而得到计算出的数据峰的值(利用图31A-31D作为例子)1.)M%-来自通道(526)测定的结果〔峰1(658)(峰2(674))〕××峰2(676)＝M%2.)M+E%-来自通道(518)测定结果〔峰1(658)(峰2(666))〕××峰2(668)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝峰2(660)-M+E%5.)B%-来自通道(532)的测定结果〔峰2(668)(峰2(684))〕××〔峰1(682)〕＝B1%B1%××〔峰1(658)〕〔峰1(666)〕＝B%6.)L%＝〔峰1(658)〕-B%
根据图31和32中所给出的数据，对射频和直流数据的计算值列在表Ⅳ中。
表Ⅳ直流 射频通道 峰1 峰2 峰1 峰2514 24.0 76.0 26.0 74.0518 63.3 36.7 62.6 37.4526 76.0 24.0 75.2 24.8532 10.6 89.4 9.7 90.3在N，L，M，E和B百分率中的整个五部分的差值，根据直流和射频峰值曾被计算过，再同一个光检测仪器的结果相比较(为了核查的目的)，正如在美国No 025442的专利申请中所述。
表Ⅴ 五部分的差值光 直流 射频N60.37 N62.1 N58.5L24.70 L22.4 L24.3M8.60 M7.6 M8.6E5.12 E6.3 E6.9B1.18 B1.6 B1.7利用直流数据峰的计算如下1.)M%＝24.0/76.0×24.0＝7.62.)M+E%＝24.0/63.0×36.7＝13.93.)E%＝(13.9)-(7.6)＝6.34.)N%＝(76.0)-(13.9)＝62.1
5.)B%＝36.7/89.4×10.6＝4.44.4×24.0/63.3＝1.66.)L%＝24.0-1.6＝22.4在图29-32中的数据峰利用一个单一的电子检测的参量(用直流信号或射频信号)曾经被描绘过，浑浊度没有说明过，但是如果需要也可以利用，因为如前述的直流/射频信号。也可以利用一个单一的光检测参数，例如中间角(median angle)光散射的结果，如在图33-36所示。
现在参看图33，细胞分类M、L、N和S借助两个参量散射和电的数量(electricalvolume)来明显分开。B在这个数据图中是模糊不清的，然而在一维的情况下，在图34中示出的同一散射数据又引起M使L模糊不清或反之，这正如在数据峰(690)中所看到的那样。在数据峰(692)中所给出的N、E以及在数据峰(693)中给出的E和图33中代表的是同样的数据。
解决在峰(690)中这个模糊不清问题的一种方法是将M分离出去。目前是用脱机或予先准备的工作模式可以完成的分离出M的操作，因为在使用CD14特定抗体(例如由Coulter Immunology Divisio of Coulter Corporation出售的MOZ)时M分离出的速度是缓慢的。例如，将400μl的全血样品同200μl的百分之2- 1/2 上面结合有CD14特定抗体的磁性微球的溶液混合，当这些磁性微球保存在磁场中时，这些磁性微球首先要通过把其中的流体分离出去实现分离。然后将该样品加入使这混合物慢慢地混合，例如摇动30分钟后，再放入磁场中约5分钟，此后这个分离出M后的混合物按照前述的操作在仪器(540)中进行分析。这个数据为了比较起见又用两维的方式，在图35中给出，从图中可以清楚地看出和图33相比M已经被贫化了，这样就放大了剩余的白血球群体的数据。
在图36中示出了一维散射结果特性，仍然获得两个特征峰(694)和(696)。峰(694)是从数据峰(690)把M分离出之后得到的，仅留下L的结果，峰(696)和数据峰(692)是相同的。峰(697)和峰(693)是相同的，峰(696)和(697)都是因为从这部分样品中分离出M而得到提高。虽然没有具体说明，这个分离出M的样品混合物是按照在峰(694)所说明的方法得到的，为了完成L的子群体的分析可以进一步说明，如下所述。
虽然在说明分析仪(500)时是用四个分开的通道来作为例子的，但是用四个通道仅仅是为了提高本发明的分类方法的速度。本发明也可以用一个单一的通道来实验，这时不同部分的生物样品(502)是被按顺序处理的。
图37示出了一个为了增强所要分类的在数量上小的或模糊的群体的测定结果的方法和仪器的分析器的实施例，该分析器用总的代号700来代表，本发明的这个方法和仪器可以用于测量含量少的群体，例如B或者子群体L。分析仪700包括一个生物样品702，该样品至少包括第一组活的生物细胞(未示出)，例如这些细胞可以在全血液样品或从全血液样品中取出的。如果是要对B细胞进行分类，那么这个样品(702)至少包括B细胞群体和至少包括白血球群体，例如L细胞，通常样品(702)应至少包括所有白血球群体，然而如前面所述，各个群体或它们的子群体可以在离线或在予准备步骤中分离。如果分类是对白血细胞的子群体进行，则这个样品(702)应至少包括具有至少一可确定子群体的白血细胞群体。
首先描述B细胞的分类，B细胞在整个白血细胞群体中是数量很少的群体，其数量通常低于百分之一，显然，把使B细胞模糊的白血细胞分离出去，将会增强B的分析和分类结果，因为这样会使B相对增大很多，而剩余白血球的相当可观的部分作为其它的白血球的群体被排除出去，很明显这种增强办法对重要的数量少的或测定结果模糊不清的细胞群体是正确的。
在分析B细胞群体时用了单一的一维一个检测量或一个参量，例如将在下面描述的在图38中的射频的结果，B因在单一的峰(704)中的L遮蔽变得模糊不清，L约占总的白血细胞群体的30%，而B就是仅仅L和B在一起也只占约3%。因此，为了更明确地分析和分类B，L应整个地或基本上全部从样品中分离出去。
样品(702)经管路(706)、与经管路(710)来的至少一个试剂(708)相混合。红血球在红血球分离装置(712)中通过前述方法之一分离出来，当红血球被分离出之后，所得到的混合物第一部分经管路(714)输送到白血球分析器(716)，这个白血球分析器可以是和上述的相同的，或者是对上述的分析器做些小的改变后的分析器。这个单个检测参量可以是电的，例如射频或直流信号，也可以是光的，例如散射或任何其它所希望的光参量。
这个混合物的第二部分经管路(718)输送到L分离装置(720)，在此处L细胞结合到磁性微球上，这些磁球上包含有L特定的单克隆抗体或者在其上面键合有这些抗体。这至少带有剩余B细胞的剩余混合物经管路(722)输送到白血球分析器(716)，这两部分的分析结果经馈线(726)输入给比较器(724)，比较这两个分析结果，从而测定样品(702)中B的百分率。用这种方法获得B从占该样品混合物的1%-3%变为大体上在第一特征峰(704)的到基本上百分之一百，从而提供了准确的分析和特征值。用类似的方法，当着所选择的CD或其它白血球群体组是比较小的情况下，可以把全部的或某些剩余的L分离出去，以便增强对重要的剩余的CD组的分析效果。
接下来描述一个或几个白血球群体的子群体进行的分析和分类，这些子群体例如是CD2、CD4或CD8白血球群体的子群体。样品(702)又将至少包括富有生命的生物细胞的第一类(未说明)，例如在全血样品中或从全血样品来。样品(702)仍应至少包括白血球群体的子群体，至少包括一个其他遮蔽的白血球群体或子群体;而样品通常包括所有的白血球群体。
样品(702)仍输送到红血球分离装置(712)，然后第一部分经管路(714)输送到白血球分析器(716)。第二部分将被用于测定例如CD2组，例如，而这样第二部分应同磁性微球混合，这些磁球包括有结合在其上面CD2特定抗体，例如是Coulter Immunaloy Division of Coulter Corporation出售的T11。分离出CD2细胞后的剩余混合物应经管路(722)输送到白血球分析器(716)。将这两个分析结果在比较器(724)比较，从而提供对CD2组细胞的特征做所要求的描述。
分析仪(700)的操作可利用所需要的相应的通道在仪器(540)上完成。当需要时，或者在一个多通道仪器上，也可以仍在一个单通道仪器上按顺序地完成。
现在参看图38-38E，根据图中示出的以一维散射图的形式描绘的特性结果来测定CD4、CD8和CD2子群体，这是利用类似于分析仪器(540)中使用的一种标准方法来完成的。每种情况下生物样品都是28μl全血样品，样品同122μl的缓冲液混合，以便对在通道(714)(它可以是仪器(540)中的通道(514))用作对照样品。为了获得图38A-E中的特征曲线，利用了一维电子检测参量(在这里是射频信号)的结果。这部分样品同300μl的红血球上面引证的(例如在容器(552)中)优选的溶剂溶解4秒钟，接着在输送到分析器(716)(例如分析器(558)之前用120μl的猝灭剂猝灭。在图38A中获得到两个明显可区分的特征峰(704)和(728)的结果，峰(704)包括B和L以及它们的所有子群体作为一个单个峰。B的百分率是很小的。以至它对所要求分析的子群体没有影响，但是，如果需要的话B的数据可以扣除。
将第二部分全血样品28μl和50μl的在上面不结合有任何L和L子群体的特定抗体的磁性微球以及72μl缓冲液相混合，这样就完成了第二个对照。样品按前述操作经溶解和猝灭后输送到分析器(716)。获得到在图38B中两个特征峰(730)和(732)。特征峰(730)和(732)与特征峰(704)和(728)是基本上相同的，因此，看来作为杂质的磁性微球对分析结果没有任何不良的影响。
将第三部分试样28μl输送到通道(718)(它可以是仪器(540)中的通道(518)、(526)和(532)中的任何一个)同50μl上面键合有CD4的特定抗体磁性微球和72μl缓冲液相混合，其中的CD4特定抗体可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T4。这部分样品混合搅拌60秒钟后，按前述方法经溶解、猝灭，在该分离后CD4子群体后的混合物输送到分析器(716)之前放在磁场中30秒钟。得到在图38C中的两个特征峰(734)和(736)，特征峰(734)代表不含CD子群体的L百分率，然后，将峰(734)和峰(704)在比较器(724)中比较后就可获得在该样品中CD4子群体的百分率。
还是为了进行检测和估价的目的，将相同的血液样品按上述方式分析以便获得四组特征峰，其中的一个描绘在图38A-E中，在每组中的特征峰基本上是相同的，因此可以只用数据的单一组。将四组的特征数据取平均就可以计算出这些结果。所计算出的CD4子群体的百分率为45.7，为了验证的目的将它同检测仪器的结果相比较，例如同从Coulter Corporation购买的EPICSB流动细胞计算器的测定结果相比较，该仪器的测定的百分率为47.6。
第四部分28μl样品被输送到通道(718)同50μl上面粘结有CD8特定抗体磁性微球和72μl缓冲液相混合，这个CD8特定抗体可以用Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T8。这部分样品按照前述的方法搅拌混合、溶解和猝灭后放入磁场中，将分离出CD8子群体后的混合物输送到分析器(716)，其测定结果由图38D中的两个特征峰(738)和(740)表示，特征峰(738)代表不含CD8子群体的L，将特征峰(738)和特征峰(704)在比较器(724)中比较，可以获得CD8子群体的百分率为25.0，为了验证此结果的可靠性，同光检测仪器的结果进行了比较，该仪器的检测结果为26.0。
第五部分28μl样品被输送到通道(718)中同50μl的上面键合有CD2特定抗体的磁性微球和72μl缓冲液相混合，CD2特定抗体可以用Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T11。仍然按照前述的方法将这部分样品搅拌混合、溶解和猝灭，然后放入磁场中。将分离出CD2子群体后的混合物输送到分析器(716)。这个测定结果由图38E中的两个特征峰所示，特征峰(702)代表不含CD2子群体的L的含量，将特征峰(742)同特征峰(704)在比较器(724)中比较就可获得CD2子群体在样品中的百分率，经计算得出的CD2子群体的百分率为82.7，为了使这个结果同光检测流动细胞计数仪的结果相比，给出后者测定出的百分率为79.0。
利用一维电子检测参量对CD4、CD8和D2子群体的其它子群体的分析结果示在图39A-E和图40A-E中。图39A-E是利用直流参量得到的，而图40A-E是利用射频参量得到的，这两个结果是用相同的样品部分在同一时间内完成的。
这部分样品按在图38A-E所述基本上相同的方法在输送到分析器(716)之前已经按顺序经溶解和猝灭。在图39A和40A的情况下只加缓冲液，而在图39B和40B的情况下除了加缓冲液外还加不带有L和L子群体抗体的磁性微球同该样品相混合，对这个不带磁性微球的对照测定出如图39A中的特征峰(746)和(748);在图40A中产生特征峰(750)和(752)。特征峰(746)和(750)代表在样品中的L和B的含量。不带磁性微球的对照结果在图39的特征峰(746)、(748)和图40A的特征峰(750)和(752)。峰(746)和(750)代表在样品中的L和B的结果。有对照磁性微球与样品混合，而用磁场从中去掉磁性微球，所得结果在图39B的特征峰(754)和(756)以及图40B的特征峰(758)和(760)示出。
将第三部分全血样品与50μl上面键合有CD4特定抗体的磁性微球相混合，这个混合物在输送到分析器(716)之前被搅拌混合、溶解、猝灭，并放在磁场中分离出CD4子群体。这个直流信号分析结果为在图39C中的特征峰(762)和(764)，而射频信号分析结果为在图40C中的特征峰(766)和(768)，在比较特征峰(746)和(762)的同时比较特征峰(756)和(766)，从而获得在样品中CD4子群体的百分率。
在图39和图40中的那些特征峰是从由同一个全血样品中的三个分开的样品组之一测得的，将这些特征峰取平均就可得到结果。在CD4的情况下，从直流信号测得的百分率是57.0，从射频信号测得百分率是57.1，而由光检测流动血球计数计测得的百分率为54.6。
为了对CD8子群体进行分析，将第四部分全血样品与上面键合有CD8子群体的特定抗体的50μl磁性微球相混合，在这个混合物输送到分析器(716)之前，这部分样品经搅拌混合、溶解、猝灭后放入磁场中，以便从该混合物中分离出CD8子群体。直流信号分析结果为在图39D中的两个特征峰(770)和(772)，而射频信号分析结果为在图40D中示出的两个特征峰(774)和(776)。
在把特征峰(746)和(770)比较的同时比较特征峰(750)和(774)，以便获得在样品中CD8子群体的百分率。在CD8的情况下，根据直流参量测得的结果是17.4，根据射频参量测得的百分率是18.6，根据光检测流动血球计数仪测得的百分率是17.7。
为了获得CD2子群体的分析结果，将第五部分全血样品与50μl上面键合有CD2子群体特定抗体磁性微球相混合。这部分样品在经搅拌、溶解、猝灭和放在磁场中把混合物中的CD2子群体分离出去之后输送到分析器(716)。直流参量的测定结果为在图39E中的两个特征峰(778)和(780)，而射频参量的分析结果为在图40E中的两个特征峰(782)和(784)。
在把特征峰(746)和(778)比较的同时比较特征峰(750)和(782)，以便获得CD2子群体在样品中的百分率，对于CD2来说，根据直流参量测定的百分率为79.6，根据射频参量测定的百分率为79.3，而根据光检测流动血球计数计的测定结果为74.7。
利用一维电子检测参量可以获得涉及关于图37-40中的B和L子群体的分析结果，除可以利用光检测参量外，还可以利用两个和更多个检测参量，例如在图41A-E中所示的结果。
这部分样品利用和为获得在图38-40中的特性而采用的相同的处理方法来处理，图41A和41B分别示出了不带磁性微球的对照和同磁性微球相结合的对照测量结果，这些磁性微球在分析之前被分离出去。这些对照正规的三部分矩形图来说明，用图说明L，M和G。
CD4的贫化示于图41C中，在CD4的子群体的磁贫化之后，将剩余的L群体可以用对照L群体相比较，以便测定CD4的子群体的百分数，测定出的CD4子群体的百分率是59.4，为了和光检测流动血球计数仪的检测结果相比，给出了该血球计数仪的测定结果为54.6。
CD8的贫化示于图41D中，在CD8子群体磁贫化之后，可以将剩余的L子群体同对照L群体相比较，可以测定CD8子群体的百分率。所测定的CD8子群体的百分率是15.8，为了便于同光检测流动血球计数仪相比较，给出了用该细胞计数仪测量的结果为17.7。
CD2的贫化示于图41E中，在CD2子群体的磁贫化之后，可以把剩余的L群体同对照L群体相比较来测定CD2子群体的百分率，测得的CD子群体的百分率82.2，然后与同光检测流动血球计数仪结果相比较，该血球计数仪测得的百分率为74.7。
从上面的分析结果可以清楚地看到，因为把L的各个子群体的百分率加起来的和总计大于100，所以说明了有一些子群体发生重叠。“重叠”一词在这里是用来指明“一定的细胞，细胞的群体，细胞的子群体或形成体至少包括两个所关心的受体或抗体”，重叠可以作为一个疾病诊断和处置中的一个重要的参量，将在下面进一步说明。
至此所有有关的特性都会遇到什么样的全血样品才称为是“正常”的问题。正常一词在这里是指明一个全血样品基本上没有受感染，例如癌、疾病等感染。
图42和43列举了对两个反常全血样品分析的结果。绘出图42A-G的第一个样品经过分析用几种不同的方式分析和显示。图42A和42B描绘了一个全血样品的两个不同的二维检测矩形图，其中一个图是用光检测的，另一个图是用电子检测的，这个血的样品未经任何处理，显然对于正常的血样的L、M和G组，例如象在图41A所示那样，是整个模糊不清的，并且刚好有一个不可鉴别的特征组。
在图42C和42D中示出了对反常的全血样品进行两种不同的处理后所测得的不同结果，对于图42C，是200μl的该血样品同200μl在上面键合有N和E特定抗体的磁性微球混合，这个混合物经搅拌混合、溶解、猝灭和保存在磁场中，另一方面将剩余的部分分离出后输送到分析器中，这时在分析器的混合物不含有键合其上的N和E细胞，显然反常细胞的主要部分已经被分离出去，因为在图42C中的图形比图42B中的图形变得更加界限分明。
在第二种处理中，将200μl该样品同200μl在上面只键合有N特定抗体的磁性微球相混合，虽然一些细胞已经分离出，表明那些细胞已键合到N抗体上了，但是反常细胞的重要部分仍然留下来，这从矩形图的顶部可以明显地看出，由此看来是出现了某些反常细胞或疾病细胞键合到N+E抗器上。这种类型的贫化处理可以用于对特定的疾病的诊断和处理。
图42A-D中的特征矩形图是利用二维检测得到的，同样的信息可以利用单一的检测参量来获得，例如一个象绘制在图42E-42G中的一维电子检测参量。这个一维检测参数在这里为直流参量，在对没有经任何处理的样品进行分析时，得到的是在图42E中绘出的矩形图。这个单一的特征峰和在远离该矩形图右侧的特征明显地表明是一反常血液样品。
仍然利用和上述的关于图42C和42D中采用的相同的处理，实际上，一维检测特性是和两维检测特征在同一时间产生的。这个分析仪器可以是如上所述的包括多个检测参量或者是只包括一个单一的检测参量的。同样要将N和E键合的细胞分离出以后，再获得图42F中的矩形图，该矩形图同样说明了大多数反常细胞已经被分离出去，在图42G中的矩形图说明了有相当可观数量的反常细胞没有被分离出去。
对第二个反常全血样品的分析结果图示在图43A-G中，其中对未经处理样品的分析结果为在图43A和图43B中的二维矩形图，显然，一个正常全血样品的图样在图中是看不到的。由仪器绘出的图43B的矩形图与离线绘制的矩形图43C相比较，发现这两个图没有明显的不同。28μl的部分样品是离线制备的或在绘制图43C之前制备的。
将一部分样品进行CD5子群体贫化，然后分析这部分样品，得到图43D中的矩形图。将28μl部分全血样品同122μl上面键合有CD5特定抗体的磁性微球相混合，其中用的CD5抗体可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T1。这个混合物经搅拌混合、溶解、猝灭后保持在磁场中以便分离出CD5键合细胞。这样就把反常细胞的主要部分分离出去，这一点可以通过把图43B或43C同图43D比较中发现。在图43A-D是用二维检测参量绘制的，而在图43E-G中的同一特征是用一维矩形图作出的。
对绘出图43E所用的在线样品或绘出图43F所用的离线样品都没有进行过处理，但绘出图43G所用的样品中的CD5子群体经贫化处理。
正如前面所讨论的重叠的细胞群体不仅对诊断是重要的，对治疗血液疾病也是重要的，例如某些未成熟的细胞表现出既是CD4受体也是CD8受体。但是，如果利用电子检测参量或最低数目的光参量或者它们简单的组合时，是不能获得细胞子群体重叠的百分率的分析结果的。例如在某些光检测仪器中，为了获得重叠数据有三个检测参量被利用，即利用正前方光散射和90°的光散射以及荧光参量。在正常全血样品中重叠群体的例子是CD2和CD8子群体。在CLL(慢性淋巴细胞白血病)中发现了一个反常子群体的重叠，在CLL疾病情况中CD5和CD20子群体发生重叠。
现在参见图44，图中用参考数字800代表一种完成细胞重叠分类的方法和装置的第一个实施例。这个仪器即分析仪(800)包括一个生物样品(802)，该样品至少包括第一组活的生物细胞(未示出)，至少包括两个重叠的白血球群体或子群体，例如在全血样品中或从全血样品中分离出来的。
生物样品(802)的这些细胞处于在定量和/或定性测定或分析过程的生物反应中。生物样品(802)可以包括该细胞加入到其中的缓冲液。
生物样品(802)经管路(804)同至少一个经管路(808)输入的试剂(806)相混合。在分析仪(800)中，红血球在红血球分离装置(810)中从该混合物中分离出，如在第一个在先的申请中所指出的那样，将红血球从装置(810)中分离出去可以用几种方法，例如在分离装置(20)中所列举的方法。
分离出红血球后的第一部分混合物经管路(814)输送到白血球分析器(812)。这样就得到了一个标准即获得了一个整个的或生物样品(802)的全部的白血球群体的对照。分析器(812)可以和分析器(86)相同，也可以是一个光检测分析器，例如在1987年3月13日申请的美国专利申请No 025442，和在1987年12月4日申请的美国专利申请No 129954，名称为“利用光散射技术的多部分差别分析装置”，这二篇申请包括在参考文件中，单一的检测参量可以是电的，例如射频或直流的，也可以是光的，例如中间角度(median angle)光散射或者任何其它所希望的光参量。
混合物的第二部分经管路(818)输送到“X”分离装置(816)，分离装置(816)把第一个(细胞“X”的)重叠群体分离出。X被分离出或者通过加入适合的上面键合有特定抗体的磁性微球的办法来贫化。根据前面的描述，利用磁铁或磁场，用磁力将键合的细胞从混合物中分离出去。经过分离出X后的剩余混合物经管路(820)输送到分析器(812)。将分离出“X”后的混合物的分析结果在比较器(822)中同第一部分混合物的分析结果相比较，就得到了在生物样品(802)中的X的百分率。
第三部分混合物经管路(826)输送到第二分离装置(824)，分离装置(824)把第二重叠的Y细胞群体分离出。Y被通过加入适当的上面键合有Y特定抗体磁性微球分离出，把分离出Y后的剩余混合物经管路(828)输送到分析器(812)，把分离出Y后的混合物分析结果在比较器(822)中同第一和第二部分混合物的分析结果相比较就可以验证，在生物样品(802)中X和Y群体是否重叠，其条件是X和Y群体或群体比率是通常已知的数值或者是被贫化的X和Y群体的总和大于100%。这个操作证明X和Y群体重叠。
在大多数情况下，第四部分混合物经管路(832)输送到分离装置(830)，分离器(830)把X和Y群体(X+Y)都分离出去。X和Y通过加入适宜的上面键合有X和Y特定抗体的磁性微球的方法来分离出。分离出X和Y后的剩余混合物经管路(834)输送到分析器(812)，可以把分离出“X”+“Y”后的混合物的分析结果同其它部分的混合物的分析结果相比较而得到X和Y群体在生物样品(802)中的重叠百分率。
可见利用管路或通道(814)、(818)和(826)，分析仪(800)可以完成单一重叠分类而利用整个四个管路，它完成的完全重叠百分率分类。分析仪(800)的重要特点是只用一个单一的分析参量就可以分析混合物。例如一电参量或一光参量。几个参量的结合也可利用，但是在每种情况下，只用单一的检测参量或者特征就可完成本发明的重叠分类。这个分析结果也可以利用多个检测参量来获得。
在这里没有列举出包括在分析仪(800)的方法和装置中的具体的分析仪器的实施例，而这样的仪器可以是仪器(540)，此外本发明的重叠方法和装置可以在仪器(540)上唯一的单通道上完成，也可以在单通道仪器上完成(未说明)。
参看图45A-45D，图中示出了一组一维散射图的重叠特征结果，这些图是利用类似于仪器(540)中的标准方法和关于仪器(800)的描述从全血样品中测得的结果。在每种情况下所用的生物样品都是28μl全血样品，利用第一通道(814)将该样品同122μl缓冲液相混合。这部分样品用上面引证的300μl红血球的优选溶剂溶解4秒钟，然后用120μl猝灭剂猝灭，然后再输送到分析器(812)中。
用一维电子检测参量(直流)对这部分的分析所得到特征图如图45A中的频率曲线图所示，在图中出现两个可清楚分辨的特征峰(836)和(838)。其中特征峰(836)代表了在样品中的L和B的百分率，而峰(838)代表了N、E和M的百分率。
接着要对该样品进行处理，按上述的方法首先进行X细胞群体贫化，然后再进行Y细胞群体的贫化处理。在这种情况下，X群体是L的CD2子群体，而Y群体是L的CD20子群体。将样品第二部分输送到分离装置(816)中，在这里用60μl上面键合有CD2特定抗体的磁性微球同这部分样品混合、搅拌、溶解、猝灭，然后放在磁场中分离出CD2子群体。然后将剩余的混合物输送到分析器(822)中，分析结果如在图45B中的两个特征峰(840)和(842)所示。特征峰(840)代表剩余的L，将它在比较器(822)中同峰(836)比较而得到在样品中CD2子群体的百分率。
将第三部分样品输送到分离装置(824)，在这里用50μl上面键合有CD20特定抗体的磁性微球同这部分样品混合、搅拌、溶解、猝灭，然后放在磁场中分离出CD20子群体。分离出CD20后的剩余混合物被输送到分析器(822)中，分析结果如在图45C中所示的两个特征峰(844)和(846)。其中峰(844)代表剩余的L的含量，将峰(844)同峰(836)相比较后，可以得到在样品中CD20子群体的百分率。
如果CD2和CD20子群体百分率的相对比值的正常值是已知的，就可以有充分根据地鉴别这些子群体是重叠的。此外，如果两个子群体的百分率相加的总和大于100，那么显然也表明这两种子群体是重叠的。在少量的百分率重叠情况下，为了验证子群体确实是重叠的，重要的是获得重叠的子群体的百分率。而为了获得重叠百分率需要进行进一步的贫化操作。
将第四部分样品输送到分离装置(830)，在这里同上面键合有CD2特定抗体的磁性微球和上面键合有CD20特定抗体的磁性微球相混合，以便分离出CD2和CD20子群体，将经CD2和CD20贫化处理过的剩下混合物输送到分析器(822)中，在图45D中得到两个特征峰(848)和(850)，特征峰(848)还代表剩余的L的含量，将特征峰(848)同特征峰(836)比较，可以获得被CD20和CD2特定抗体分离出后的子群体的百分率，将这个结果同单个的CD2和CD20的结果相比较，就可以获得可能存在的重叠的百分率。
精确的重叠百分率按下面公式计算Ⅰ.子群体“A”(CD2)(a) ((特征峰838))/(特征峰842) ×(特征峰840)＝A′(b) ((特征峰836-A′))/(特征峰836) ＝%子群体A(CD2)Ⅱ.子群体“B”(CD20)(a) ((特征峰838))/(特征峰846) ×(特征峰844)＝B′
(b) (特征峰836)-B′)/(特征峰836) ＝%子群体B(CD20)Ⅲ.子群体“A+B”(CD2+CD20)(a) ((特征峰838))/(特征峰850) ×(特征峰848)＝A+B(b) (特征峰836-(A+B))/(特征峰836) ＝子群体A+B的%Ⅳ.重叠部分〔子群体“A”+子群体“B”〕-子群体〔“A”+“B”〕＝重叠结果(对从两个分开制备的样品所测得的结果取平均的)列在表Ⅵ中表Ⅵ峰 相对百分率 峰 相对百分率对照 836 35.7 838 64.3CD2 840 7.1 842 92.6CD20 844 33.6 846 66.4CD2+CD20 848 3.5 850 96.5表Ⅵ 4的相对百分率是总的百分率为100的两个峰的百分率。计算出的CD2百分率为86.2，CD20百分率为8.9，而CD2+CD20的百分率为93.5。因此重叠百分率为(86.2+8.9)-93.5＝1.6。
为了得到在图46A-D中的CD2和CD8子群体的重叠百分率，要将第二个样品作贫化处理，再将该样品的第一部分输送到通道(814)，为了获得在图46A中所示的对照特征，样品没有经贫化处理，这个特征归结为两个明显分开的特征峰(852)和(854)，特征峰(852)代表样品中的L和B的百分率。
将第二部分样品按在通道(818)中前述的方法进行CD2子群体贫化处理，在图46B中得到两个特征峰(856)和(858)，代表剩余L的特征峰(856)同对照峰(852)相比较，而获得在样品中CD2子群体的百分率。
将第三部分样品在通道(826)中对CD8子群体进行贫化处理，测得如图46C中的两个特征峰(860)和(862)。将特征峰(860)同外照峰(852)相比较而得到CD8子群体在样品中的百分率。
将第四部分样品在通道(832)中对CD2+CD8子群体进行贫化处理，测得如图46D中所示的两个特征峰(864)和(866)，将特征峰(864)和对照峰(852)相比较而获得在样品中CD2+CD8的子群体的百分率。
这些数据列举在表Ⅶ中表Ⅶ峰 相对百分率 峰 相对百分率对照 852 30.3 854 69.7CD2 856 9.0 858 91.0CD8 860 22.1 862 77.9CD2+CD8 864 7.6 866 92.4计算得到的CD2的百分率为77.3，CD8的百分率是34.7，以及CD2+CD8的百分率是81.1。因此重叠的百分率是(77.3+34.7)-81.1＝30.9。
虽然本发明的方法和装置是结合利用全血样品来描述的，但是可能有那样的情况，需要利用包含红血球的群体和/或不包含白血群体后的样品。显然，红血球仍需分离出，但是，是在本发明的装置里面、还是在外部进行这种分离是有争议的。这样的分离或制备可以用多种常规手段在外面进行，例如利用溶解剂、密度或离心技术，如象菲克尔水溶性聚蔗糖(ficol)，葡聚糖，血沉检查层(buffyloat)等，在利用本发明的自动分析器时，为了快速和完整地对样品进行分析，最好是利用全血样品。
利用上述技术中的光参量可以改进和变动本发明，样品12，42，150，180，294，322和342可以包括全血，包括有细胞的人体液或其它的包括构成身体的流体，例如细菌、病毒和真菌。确定的微球的体积是指出用单位稀释液的微球的重量来表示。虽然样品的数量例如对于一个全血样品采用的是20μl的量级，但是这仅是作为一个例子。根据需要也可以用比较小的或比较大的样品体积，例如对于特殊的仪器或技术可以用象约2μl小体积的样品来分析，虽然在某些例子中是按顺序完成的，但是这些操作步骤也可以同时完成，同时进行分析要求仪器利用最不复杂仪器组件。因此，不难理解，在权利要求书的范围内，本发明在实际上不限于已经描述的实施例。
权利要求
1.一种获得来自全血样品至少一部分的至少一种白血球群体分析结果的方法，该全血样品至少含有白血球群体和/或子群体，其特征在于分析该全血样品的至少第一部分来测定该全血样品的至少一种白血球群体或子群体的特征值；从全血样品的至少第二部分贫化至少一种白血球群体或子群体；分析该全血样的所述第二部分，以测定所述第二部分的至少一个白血球群体或子群体的特征值；比较所述的两个分析的特征值，确定该全血样品的至少一个白血球群体或子群体的百分率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于把所述第二部分白血球群体或子群体除去，是通过提供一种磁性微球，该微球键合有对所述白血球群体或子群体特异的单克隆抗体，把所述磁性微球与所述样品混合，以键合所述白血球群体或子群体，用一个磁场吸引所述磁性微球，在所述磁性微球约束在所述磁场中时，除去所述样品的剩余的至少一部分，这些就除去了所述白血球群体或子群体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在分析所述第二部分样品前，从所述第二部分白血球群体或子群体中至少除去嗜中性细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于从所述全血样品的至少第三部分除去至少两个白血球群体或子群体;分析所述全血样品的第三部分，确定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体特征值;以及比较所述的三个分析的特征值，确定所述全血样品的至少两个白血球群体或子群体的百分率。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于除去所述第三部分白血球群体或子群体，是通过提供一种键合有对所述白血球群或子群体特异的单克隆抗体的磁性微球，把所述磁性微球与所述样品混合，以结合所述白血球群体或子群体，在所述磁性微球约束在一个磁场内时，除去所述样品剩余的至少一部分，从而除去所述白血球群体或子群体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于在分析所述的第三部分之前，从所述第三部分白血球群体中至少除去嗜中性细胞和嗜曙红细群体。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于在分析所述的第三部分之前，从所述的第三部分白血球群体中至少除去淋巴细胞和嗜中性细胞。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于从所述全血样品的至少第四部分中至少除去两种白血球群体或子群体;分析所述全血样品的所述第四部分，测定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体特征值;比较至少所述四个分析的特征值，确定所述全血样品的至少三个白血球群体或子群体的百分率。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于比较至少四个分析白血球群体特征值，计算或确定所述全血样品的至少嗜曙红细胞，单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性白细胞的白血球群体的百分率，完成五部分白血球的区分。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述全血样品包括一红血球群体，从所述样品中除去红血球群体对有关的所述白血球群体的至少一种群体的相关定性和/或定量无明显的有害影响。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于用一个电参数，用电子仪器分析所述部分。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于用一个光参数，光学分析所述部分。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于比较所述的两个分析的特征值，确定至少一个白血球群体的至少两个子群体的百分率。
14.一种用于从一个全血样品的至少一部分中得到至少一个白血球群体分析法的装置，该全血样品至少含有白血球群体和/或子群体，其特征在于，包括用于分析所述全血样品的至少第一部分，以测定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体特征值的组件(514、512、552、558);用于从所述全血样品的至少第二部分基本上贫化掉其中的至少一个白血球群体或子群体的组件(516);用于分析所述全血样品的所述第二部分，测定所述第二部分的至少一个白血球群体或子群体的特征值的组件(520、512、558);用于比较所述的两个分析的特征值，确定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体的百分率。
15.如权利要求14所述的装置，其特征在于用于除去所述第二部分白血球群体或子群体的所述组件包括用于提供键合有对所述白血球群体或子群体特异的单克隆抗体的磁性微球的部件(588);用于把所述磁性微球与所述样品混合，以结合所述白血球群体或子群体的部件(586);以一个磁场吸引所述磁性微球的部件(592);用于除去所述白血球群体或子群体的部件(520)，这种除去是当所述磁性微球约束在所述磁场内时除去所述样品的剩余的至少一部来实现的。
16.如权利要求14所述的装置，其特征在于还包括在分析所述第二部分之前，从所述的第二白血球群体或子群体中至少除去嗜中性白血球群体的组件。
17.如权利要求14所述的装置，其特征在于还包括用于从所述全血样品的至少第三部分中除去至少两个白血球群体或子群体的组件(524);用于分析所述全血样品的所述第三部分，测定所述全血样品的至少一个白血球群体或子群体的特征值的组件(512，558);用于比较所述三个分析的特征值，确定所述全血球的至少两个白血球群体或子群体的百分率的组件(522、580)。
18.如权利要求17所述的装置，其特征在于用于除去所述第三部分白血球群体或子群体的所述的组件包括提供键合有对所述白血球群体或子群体有特异性的单克隆抗体的磁性微球的部件(596);用于把所述磁性微球与所述样品混合结合所述白血球群体或子群体的部件(600);在所述磁性微球吸引在一个磁场内时，除去所述样品的剩余的至少一部分，来除去所述的白血球群体或子群体的部件(528)。
19.如权利要求17所述的装置，其特征在于还包括在分析所述的第三部分之前，从所述的第三部分白血球群体中至少除去嗜中性白血球和嗜曙红细胞群体的组件。
20.如权利要求17所述的装置，其特征在于还包括在分析所述的第三部分之前，从所述的第三部分白血球群体中至少除去淋巴细胞和嗜中性白血球群体的组件。
21.如权利要求17所述的装置，其特征在于还包括从所述全血样品中除去至少两个白血球群体或子群体的组件(530);用于分析所述全血样品的所述第四部分，测定所述全血样品的至少一白血球群体或子群体特征值的组件(534，512，588);用于比较至少所述的四个分析的特征值，确定所述全血样品的至少三个白血球群体或子群体的百分率的组件(522，580)。
22.如权利要求21所述的装置，其特征在于还包括用于比较至少四个分析的白血球群体特征值，以计算或确定所述全血样品的至少嗜曙红细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性白血球群体的百分率的组件。
23.如权利要求14所述的装置，其特征在于所述全血样品包括一红血球群体，并且包括一用于从所述样品除去该红血球群体，而对有关所述白血球群体至少一个的有关定性和/或定量无明显的有害影响的装置。
24.如权利要求14所述的装置，其特征在于还包括用单一电参量进行电学分析所述部分的组件。
25.如权利要求14所述的装置，其特征在于还包括用单一光参量对所述部分进行光学分析的组件。
26.如权利要求14所述的装置，其特征在于还包括用于比较所述的两个分析的特征值，确定至少一个白血球群体的至少两个子群体的百分率。
27.一个对一全血样品至少一部分中，增强和获得至少一种白血球群体或白血球群体的子群体分析的方法，在该全血样品中至少有白血球群体，其特征在于分析所述全血样品的至少第一部分，测定所述全血样品的至少一个白血球群体或白血球群体的子群体的特征值;从所述全血样品的至少第二部分中除去至少一白血球群体或白血球群体的子群体，那个白血球群体或白血球群体的子群体遮蔽要分析的白血球群体或白血球群体的子群体的分析结果;分析所述全血样品的所述第二部分，测定所述第二部分有关至少一个所需要的白血球群体或白血球群体的子群体的特征值;以及比较所述的两个分析得的特征值，确定所述全血样品的有关的至少一个所需要的白血球群体或白血球群体的子群体的百分率。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，把所述第一部分白血球群体或白血球群体的子群体分离出去;提供一键合有对所述白血球群体或白血球的子群体有特性的单克隆抗体的磁性微球，把所述磁性微球与所述样品混合，以键合所述白血球群体或白血球群体的子群体，在吸引所述磁性微球到一个磁场内的同时，分离出所述样品剩余的至少一部分，从而除去了所述的白血球群体或白血球群体的子群体。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，在分析所述第一部分之前，从所述第一部分白血球群体中至少除去淋巴细胞群体，从而获得所述全血样品嗜碱性细胞群体百分率。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于在分析所述第一部分之前，从所述全血样品的所述第一部分中至少除去一个所关心的白血球群体的子群体，以获得所述全血样品的有关的白血球群体的子群体百分率。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述的全血样品包括一红血球群体，从所述样品中除去该红血球群体，对所关心的所述白血球群体或子群体中至少一个的定性和/或定量无明显的有害影响。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于用单一的电参量，用电学分析所述部分。
33.如权利要求27所述的方法，其特征在于用单一的光参量，用光学分析所述部分。
34.如权利要求27所述的方法，其特征在于用至少两个检测参量分析所述部分。
35.一种用于增强和获得从一个全血样品的至少一部分中的至少一种白血球群体或白血球群体子群体分析结果的装置，该全血样品至少包含有白血球群体，其特征在于包括用于分析所述全血样品的至少第一部分，测定所述全血样品的至少一白血球群或白血球群体子群体的特征值的组件(512，558);用于从所述全血样品的至少第二部分除去至少一白血球群体或白血球群体子群体的组件(516)，这些白血球群体或白血球群体的子群体遮蔽所要求分析的白血球群体或白血球群体子群体的分析结果;用于分析所述全血样品的所述第二部分，测定所述第二部的有关至少一个所要求的白血球群体或白血球群体子群体的特征值的组件(512，558);用于比较所述两个分析的特征值，确定所述全血样品的有关所述至少一个所要求白血球群体或白血球群体子群体的百分率的组件(522，580)。
36.如权利要求35所述的装置，其特征在于用于除去所述第一部分白血球群体或白血球群体子群体的组件包括一提供磁性微球，该微球键合有对所述白血球群体或白血球群体子群体特异的单克隆抗体的部件;用于把所述磁性微球与所述样品混合，键合所述白血球群体或白血球群体子群体的部件(586);以及在吸引所述磁性微球到一磁场中时，把所述样品的剩余的至少一部分除去，从而除去所述白血球群体或白血球群体的子群体的部件(584)。
37.如权利要求35所述的装置，其特征在于，还包括在分析所述第一部分之前，从所述第一部分白血球群体中至少除去淋巴细胞群体，从而获得所述全血样品的嗜碱性细胞群体百分率的组件。
38.如权利要求35所述的装置，其特征在于，还包括在分析所述第一部分之前，从所述全血样品的至少第一部分中除去有关的至少一个白血球群体子群体，从而获得所述全血样品的有关的所述白血球子群体百分率的组件。
39.如权利要求35所述的装置，其特征在于，所述全血样品中包括一红血球群体，还包括一用于从所述样品中除去红血球，而对至少有关的所述白血球群体或子群体一个相关的定性和/或定量无明显的有害影响的部件。
40.如权利要求35所述的装置，其特征在于，还包括用单一电参量电分析所述部分的组件。
41.如权利要求35所述的装置，其特征在于，还包括用单一光参量光学分析所述部分的组件。
42.如权利要求35所述的装置，其特征在于还包括用至少两个检测参数分析所述部分的组件。
43.一个从一全血样品至少一部分中获得至少两个白血球子群体的重叠群体的百分率的方法，该全血样品至少有两个白血球子群体，其特征在于分析所述全血样品的至少第一部分，测定所述全血样品的至少一个白血球群体的特征值;从所述全血样品的至少第二部分基本上贫化掉所述白血球子群体的至少第一个;分析所述全血样品的所述贫化过的第二部分，测定所述白血球群体或所述第一子群体的至少一个特征值;从所述全血样品的至少第三部分中基本上贫化掉所述白血球子群体的至少第二个;分析所述全血样品的所述贫化过的第三部分，测定所述白血球群体或所述子群体的至少一个特征值;以及比较所述三个分析的特征值，确定所述白血球样品的所述两个白血球子群体的抗原重叠。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于从所述全血样品的至少第四部分中基本贫化掉至少两个所述第一和第二白血球子群体，测定所述白血球群体或所述第一和第二白血球子群体的至少一个特征值;以及比较所述四个分析的特征值，确定所述全血样品的所述两个白血球子群体的重叠抗原的百分率。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于用单一电参量电分析所述部分。
46.如权利要求43所述的方法，其特征在于用单一光参量光学分所述部分。
47.如权利要求43所述的方法，其特征在于用至少两个检测参量分所述部分。
48.一种从一全血样品至少一部分中获得至少两个白血球子群体的重叠群体的百分率的装置，该全血样品至少有两个白血球子群体，其特征在于包括用于分析所述全血样品至少第一部分，测定所述全血样品的至少一白血球群体特征值的组件(512，558);用于从所述全血样品的至少一第二部分中基本上贫化所述白血球子群体的至少第一个的组件(516);用于分析所述全血样品的所述第二贫化部分，测定所述白血球群体或所述第一子群体的至少一个特征值的组件(512，558);用于从所全血样品的至少第三部分中基本上贫化掉所述白血球子群体的至少第二个的组件(524);用于分析所述全血样品的所述第三贫化部分，测定所述白血球群体或所述第二子群体的至少一个特征值的组件(512、558);以及用于比较所述的三个分析特征值，确定所述全血样品的所述两个白血球子群体的抗原重叠的组件(522、580)。
49.如权利要求48所述的装置，其特征在于还包括用于从所述全血样品的至少第四部分中基本上贫化掉至少所述第一和第二白血球子群体两者，测定所述白血球群体或所述第一或第二白血球子群体的至少一个特征值的组件(530);以及用于比较所述四个分析特征值，确定所述全血样品的所述两个白血球子群体的重叠抗原的百分率的组件。
50.如权利要求48所述的装置，其特征在于还包括用于只用单一电参量电学分析所述部分的组件(522、580)。
51.如权利要求48所述的装置，其特征在于还包括用于仅用单一光参量光分析所述部分的组件。
52.如权利要求48所述的装置，其特征在于还包括用于至少用个检测参量分所述部分的组件。
全文摘要
一种自动和快速地对至少一种选定的细胞群体或生物体例如一全血样品或其部分白血球群体和其至少一个子群体进行弥补，计算和/或分析的方法和装置。制备一定体积含WBC的生物介质，至少对一些选定的生物细胞特异或最佳的至少一试剂放入样品中，并快速混合一短时间，一多路血球分析器通过至少贫化-WBC子群体，以单一检测参量测量，通过除去一个或多个遮蔽的WBC子群体，也可获得一所要的WBC群体子群体或WBC子群体重叠的百分率。
文档编号G01N15/10GK1050771SQ9010392
公开日1991年4月17日 申请日期1990年4月14日 优先权日1989年4月14日
发明者托马斯·鲁塞尔, 卡洛斯·M·罗杰昆斯, 康斯坦斯·玛莉·海杰克, 华莱士·H·科特 申请人:科特电子公司