专利名称：癌内因及其测定方法
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本发明涉及对癌内因的分析以及对癌内因的测定方法。
致癌因素广泛分布于自然界，而癌症仅出现在生物界，致癌物必须与生物体作用才能产生癌症，因此，癌症的发生必须有生物体方面的因素参与。
一、癌症的分布癌症虽然复杂，但是其分布还是有规律的。
从细胞水平研究，癌症的范围只限于有分裂能力的细胞。因为“任何有分裂能力的细胞均会癌变”。
从组织水平研究，癌只分布于神经组织、上皮组织、肌肉组织和结缔组织四大组织之任何组织。
从系统水平研究，癌症发生于任何系统，呼吸系统、循环系统、运动系统、消化系统、造血系统、泌尿系统、生殖系统、神经系统均无一例外地发生肿瘤。
从哺乳动物水平研究，猪马牛羊及人类无一例外地发生癌症，癌症分布于整个哺乳类。
从脊椎动物水平研究，哺乳类、爬行类、鸟类、两栖类、鱼类无一例外地发生癌症，癌症分布于整个脊椎动物门。
从动物水平研究，癌症不仅仅分布于脊椎动物，棘皮动物(如海胆)发生癌症;软体动物(如黄蛞蝓)发生癌症;节肢动物(如某些蝇和蝴蝶的幼虫)也发生癌症;虽然对于环节动物门、绒形动物门、扁形动物门、腔肠动物门等有无癌症没有报道，但有一点是肯定的，即癌症分布于动物界。
从生物水平研究，癌症不仅分布于动物，也分布于植物，可见癌症分布于生物界。
从自然界水平研究，癌症分布于生物界，没有生命的物质不发生癌症，说明癌症分布的最大范围是生物界。
附表不同研究水平肿瘤的分布图
总之，对于自然界不产生癌变的，归结如下(1)自然界中无生命的物质，本身不会产生肿瘤;
(2)生物界中，无细胞结构者，不发生癌变。如病毒只能在宿主产生肿瘤，病毒本身不会变成癌细胞;
(3)单细胞生物，不发生癌变。如原核生物(细菌)、真核原生生物(原虫)等，具有完整的细胞结构，有分裂能力，但不发生癌变;(9)(4)多细胞生物，无分裂能力的细胞，不发生癌变。如哺乳类动物成熟的心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞等，失去了分裂能力，不发生癌变。
二、致癌因素分布目前已经定论的致癌因素有生物因素、物理因素和化学因素等。与癌症的分布特点不同，这些因素，广泛分布于自然界。如生物因素，病毒、细菌毒素、霉菌毒素广泛分布于空气、土壤及水中;阳光则照耀着宇宙间万事万物，紫外线、放射性物质等均如此，日本广岛原子弹爆炸辐射致癌时，射线也并非只对人类发生辐射;化学性致癌物质也广泛分布于土壤、水和空气中。
致癌因素分布于自然界，只有与癌症的分布比较，才会发现其重要意义。
三、癌内因首先，请看表致癌因素分布 癌症分布生物界 + +非生物界 + -上表说明，致癌因素+生物体才会产生肿瘤;致癌因素+无生命物质则不产生肿瘤。为什么分布于自然界的致癌因素单单在生物界产生肿瘤？可见在癌变的环节中，生物方面也有其十分重要的作用，离开了生物方面的原因，癌症便不会产生，没有生物，也无所谓癌症。我们把癌变过程中，生物方面能够和任何致癌因素相互作用的因素，称之为癌内因。
研究癌内因对于研究癌症的病因具有十分重要的意义。因为癌内因，只存在于生物界，大大缩小了其研究的范围。组成生物的分子是核酸、蛋白质、脂、糖、酶、维生素、水、无机盐等。自然界中存在的氨基酸有数百种，组成生物蛋白质的氨基酸只有20余种。自然界中存在的元素有一百多种，组成生物的元素只有C、H、O、N、S、P、金属元素以及微量元素。
因此，癌内因如果只有一个，那么，它只能是一种生物(大)分子、或是一种氨基酸、或是某一种元素。所有的致癌因素(理化、生物)必须先与癌内因作用，而后产生全部的癌症的特点，如基因改变、无限生长等。这个癌内因，是具有分裂能力的细胞共有的因素，是动物、植物体内共有的成份，也是生物进化中最原始的成份。
设癌变只有一个癌内因。
四、基因突变不是癌变的原因基因是位于染色体上的遗传因子。一方面，它通过细胞分裂时染色体的复制而一代一代地遗传下去;另一方面，它控制生物的发育、生理及生化过程，从而使生物表现出各种各样的性状。基因的化学实质是DNA。在含有DNA的生物中，DNA是遗传物质，基因在DNA上;在不含有DNA而只含有RNA的生物中，RNA是遗传物质，基因在RNA上;表现生物性状的蛋白质是不遗传的。
DNA的复制具有极高的速度和惊人的精确度，以dATP，dGTP、dTTP、dCTP为原料，以DNA polymerase和镁离子为催化剂，以依赖DNA的由RNA聚合酶合成的小片RNA为引物，合成复制细胞分裂时所必须的DNA。
因此，遗传基因决定了子代细胞的遗传性状，但是，DNA的复制过程，是由DNA聚合酶和镁离子催化完成的。可见有了基因，生物体发育、生理、生化过程中的调控，就有了固定的模式，但是遗传基因并不能亲自完成生物体的发育及生理和生化过程，而仅是对上述过程起调控作用。
人体的组织细胞分为三大类群旺盛分裂细胞群;暂不分裂细胞群;永不分裂细胞群。如果说基因变化是癌变的原因，那么，基因必须决定细胞的分裂能力。上述三类细胞群，具有相同的遗传基因，为什么有的细胞永不增殖？有的细胞间歇增殖？有的细胞旺盛增殖呢？如果基因能够决定细胞的分裂增殖，那么，上述三种细胞均应旺盛增殖才是(因为基因相同)，为什么结果不是这样呢？如果永不增殖的细胞发生了基因突变，而基因突变又是癌变的原因，那么，为什么没有分裂能力的细胞不会癌变呢？又如旺盛增殖的细胞发生了基因突变，而基因突变是癌变的原因，那么，为什么癌变细胞的细胞周期比其来源组织细胞不仅不缩短，反而有所加长？肿瘤组织的生长速度远远高于其来源组织，试问瘤组织生长过快的原因是什么呢？致癌因素作用于特定的组织;使某一组织发生癌症，绝大多数癌症产生后(对于人类)，致癌因素并没有去除掉，为什么只会引起正常细胞基因变化，而不再导致癌细胞的遗传基因改变呢？病毒、噬菌体含有自己完整的遗传基因，离开了宿主细胞，就失去了自我繁殖能力。病毒的遗传基因也会发生突变，尽管会基因突变，其自我繁殖，仍然离不开宿主细胞，又是为了什么？古今中外的学者，谁能在没有酶参与的条件下，将DNA模板、磷酸、碱基放在一起便会合成DNA？正如有了制造飞机的图纸，有了制造飞机的工厂和原料，如果没有技术工人就不能生产飞机一样，我们不能说是飞机图纸制造了飞机，决定飞机的生产与否、产量高低、性能好坏等，依靠的是那些生产者。
同样道理，基因恰恰类似于图纸，对于细胞的分裂与癌变，不能起决定作用。
五、癌变与细胞分裂D.Schmahl(1962)说过凡是有分裂能力的细胞均会癌变。尤复翰(1982)又指出分化成熟的红细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞无分裂能力，不发生癌变。可见细胞的分裂对于细胞的癌变是多么重要。
既然不发生分裂的细胞不癌变，那么癌变的内因就不存在于无分裂能力的细胞，因而癌内因只分布于有分裂能力的细胞。要弄清癌变的机制，必须先弄清细胞分裂的机制。可惜的是，正如人们不明白什么是癌症病因一样，人们对于细胞分裂的机制也不十分了解。
究竟什么因素决定细胞分裂呢？在动植物细胞分裂过程中，许多激素均会影响细胞的生长，又如年龄、营养、健康状况等，这就明这些因素对于细胞的生长(增殖与增长)十分重要。但是对于细菌及原虫这些单细胞生物来说，并无上述各种因素参与，也同样具有分裂能力，这说明决定细胞分裂能力的因素在细胞本身，而不是来自细胞外。因此，癌内因的分布范围，只限于有分裂能力的细胞内，也就是说，在一个细菌细胞的本身就含有导致癌变的癌内因。
因此，我们把癌内因的分布范围从自然界缩小到生物界，又从生物界缩小到有分裂能力的单个细胞。
结论癌内因的分布范围，存在于任何具有分裂能力的细胞中。
六、癌内因决定于哪种生物分子组成生物的分子主要有核酸、蛋白质、脂类、糖类、酶、维生素以及无机盐。癌变的内因究竟决定于哪种分子呢？核酸是极重要的生物分子，包括DNA和RNA，主要位于细胞核内，尤其DNA，是染色体的基本化学成份。决定生物遗传的基因，是由DNA分子中碱基顺序决定的。那么在目前学术界，普遍认为基因突变是癌变的原因，照此说法，癌变的内因应该由核酸尤其是DNA来决定。
发育成熟的红细胞没有细胞核，同时也不具有分裂能力，这说明细胞核对于细胞的分裂，是必备的结构，可见核酸(尤指DNA)是细胞分裂必需的生物分子。
然而在发育成熟的心肌细胞、骨骼肌细胞和神经元，均拥有完整的细胞核，却仍然没有分裂能力。可见对于细胞的分裂，单有细胞核是不够的。进而说明核酸是必备的，但不是唯一的决定细胞分裂的生物分子。
脂类是细胞生物膜结构中最重要的化学成份。当细胞失去细胞膜，细胞就死亡，说明细胞的生存必需依赖细胞膜。但是细菌等原核生物，本身没有核膜，同样具有分裂能力;哺乳动物成熟的心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经细胞均拥有完整的生物膜，却不具有分裂能力。说明生物膜是细胞生存所必需的基本结构，但细胞的分裂，并不能由生物膜来决定。脂类主要分布于生物膜，可见脂类对于细胞的生存是不可缺少的化学成份，但是对于细胞的分裂来说，脂类却不是决定性的生物分子。
糖类是另一类生物分子，一方面氧化分解供能，另一方面是核酸的合成原料，可见也不是细胞分裂的决定因素。
以上分析可以看出，决定细胞分裂的因素，不是核酸，不是脂类，也不是糖类。癌变的前提是细胞分裂，说明癌内因，不是核酸、不是脂也不是糖类。
在余下的生物分子中，只有蛋白质、酶、维生素和无机盐类。维生素是酶的辅助成份，参与催化体内的化学反应过程，因此，维生素和酶比较，酶的重要性要大得多;比较酶与蛋白质，可以发现酶是特殊的蛋白质，具有蛋白质的所有性质，又含有超越蛋白质的生物功能。种种事实表明，如果在这些生物分子中，一定要寻找一种能够决定细胞分裂的成份，而且只有这唯一的成份时，只能选择酶分子。
因此，决定细胞分裂的生物分子，最大可能是酶，所以决定癌变的生物分子是酶分子。
七、肿瘤生长的机制肿瘤组织与正常组织最大的区别是前者能够无限制的生长。任何肿瘤组织均来源于正常组织，那么肿瘤组织为什么会无限生长呢？肿瘤组织与正常组织一样具有三种细胞群A-连续增殖细胞群;B-间歇增殖细胞群;C-永不增殖细胞群。肿瘤组织增殖系数(GF)公式为GF＝ (A)/(A+B+C)什么因素导致肿瘤生长过快呢？很明显，只有GF值升高，组织的生长才会加快。如何才会使GF值升高呢？只有研究A、B、C三种细胞群才会明白。
C细胞群不发生增殖。没有分裂能力，因而不发生癌变，对于肿瘤组织的生长没有意义，此处不加考虑。
A细胞群是处于旺盛增殖的细胞群，目前考虑肿瘤组织生长过快的主要原因是A细胞群癌变，增殖过快所引起。其实这种观点是完全错误的。请看表1，肿瘤细胞的细胞周期不比其来源组织细胞的周期短，有些反而有所加长，试问GF值如何会升高呢？GF值不升高，试问肿瘤组织如何生长快呢？如何无限制地生长呢？B细胞群是暂不增殖细胞群，在公式GF＝ (A)/(A+B+C) 中，如果使GF值增大，A、B、C三大类细胞群必须有所变化。肿瘤组织GF值肯定是增大的，即C和A细胞群对于GF值的变化(变大)没有影响，可见唯一能够改变GF值的只有B细胞群。
在某些情况下(如损伤)，B细胞群能够恢复增殖能力，转入A细胞群，此时GF的公式已发生了改变。
GF＝ (A+B)/(A+B+C) 或GF＝ (2A)/(2A+C)如果组织细胞只有一个转化为癌细胞，则此时产生肿瘤的组织增殖系数GF＝ (A+B)/(A+B+C) (n＝1)。
当癌细胞分裂1次，GF＝ (2A+2B)/(2A+2B+C) ，(n＝2)当癌细胞分裂2次，GF＝ (4A+4B)/(4A+4B+C)当癌细胞分裂3次，GF＝ (8A+8B)/(8A+8B+C)当癌细胞分裂n次，GF＝ (2n(A + B))/(2n(A + B) + C)在公式GF＝ (2n(A + B))/(2n(A + B) + C) 中，随着n→∞，2n(A+B)+C愈来愈接近于2n(A+B)，而C细胞群的细胞数目能够忽略不计，此时GF＝1，B最大值。前面已经证明肿瘤组织GF公式为GF＝ (2n(A + B))/(2n(A + B) + C)可见，当n＝0时，GF值最小，当n＝∞时，GF值最大。这说明，肿瘤发生后，随着时间的延长，分裂次数的增多，其GF值愈来愈大，于是肿瘤组织的生长愈来愈快。
由于C细胞群不发生增殖，因此在瘤组织生长中其数目不变，当瘤细胞随时间延长经过无数次分裂后，C细胞群的数目愈来愈相对减少直至忽略不计。在恶性肿瘤组织中，既未能看到神经纤维，也未能发现神经末梢，便是由于神经细胞属于C细胞群。
总之，肿瘤组织的发生与生长，取决于暂不增殖的B细胞群向连续增殖细胞群的转化。细胞增殖能力的恢复，必须使G0期细胞进入G1期或G2期。G1期是DNA合成前期，此期主要产生合成DNA的酶类;G2期是DNA合成后期，细胞在此期主要合成细胞分裂所必须的蛋白质。而处于增殖状态的细胞，在转化为G0细胞时，恰恰是从G1和G2期进入G0期，尤其G1期细胞，更易进入G0期。因此G0期细胞转化为G1或G2期细胞的先决条件是拥有足量的高活性的完成DNA复制与蛋白质合成的酶类。
八、癌组织细胞中酶学变化DNA复制酶类，在哺乳动物中有DNA polymerase αDNA polymerase βDNA polymerase γ蛋白质合成的场所是核糖体，最重要的酶是氨基酸活化酶。
以上四种酶，除DNA polymerase β的活性中心含有二硫键(-S-S-)外，其余三种酶的活性中心均含有巯基。
Michael在《DNA polymerases of animal cells》中，详细地记述了三种DNA polymerases的作用及特性，指出α、γ两种酶主要用于DNA的合成和复制，而DNA的损伤修复则依靠DNA polymerase β，恶性肿瘤组织中DNA polymerase α、γ活性及含量升高，DNA polymerase β活性及含量下降已经由众多的学者证实;肿瘤组织蛋白质合成旺盛也提示氨基酸活化酶的活性应该升高。什么原因才会促使上述四种酶在肿瘤组织中产生上述变化呢？只有一个，即，在肿瘤组织中巯基(-SH)物的含量应该升高。
从上四种酶的变化，可以使G0期细胞和G1、G2期细胞之间转化。但肿瘤细胞的糖代谢以无氧酵解为主，详实的科研资料也充分证明了参与糖酵解的11种酶中，有磷酸化酶、磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶、醛缩酶等的活性及含量，在肿瘤患者均显著升高。巧的是，这些酶的活性中心均含有数目不等的巯基。什么因素会产生这些酶活性共同升高的结果呢？只有一个，即，在肿瘤组织中巯基(-SH)物的含量应该升高。
脂类是细胞膜重要的组成成份，细胞的旺盛分裂离不开脂类增多的物质基础，这说明，瘤组织中脂类的合成代谢应该是旺盛的。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成多酶体系完成催化的。生物界中已发现有两类脂肪酸合成多酶体系，有哺乳动物型和大肠杆菌型，两者均需酰基载体蛋白，而酰基载体蛋白的活性中心含有巯基。
可见，脂类的合成酶系，在活性升高时，也必须有条件，即巯基物的含量应升高。
此外，肝脏肿瘤、前列腺癌患者中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性及含量升高已是多年来临床上极重要的诊断指标。此二酶的活性中心也均含有巯基。
那么，肿瘤组织中巯基含量是否升高呢？九、癌组织中巯基含量的变化从理论上讲，导致癌组织一系列变化的原因，应该是癌组织中巯基物含量的升高。但讫今为止，国内外有关巯基与肿瘤的关系从无报道，从致癌的化合物、药物及至激素来看，直接含有巯基的物质极罕见。鉴于此，笔者在复旦大学生物化学系黄伟达主任指导下，对人和动物多种肿瘤和瘤周组织中巯基含量，进行了测定，结果如下页表2所示。从中看出，全部肿瘤组织的巯基摩尔含量，均显著高于其周围对照组织，且随肿瘤恶性程度的升高，其巯基的摩尔含量升高愈显著。
那么，为什么癌组织中巯基的摩尔含量会升高呢？这些巯基是来自巯基酶还是来自其它物质呢？巯基的摩尔数目增多是癌变的原因还是癌变的结果呢？十、癌组织巯基变化的机制
(一)生物体内巯基的来源巯基(-SH)是生物体内半胱氨酸的分子上的功能基因之一，其化学性质活泼，很容易被氧化，也常参与多种化学反应，巯基在生物体内主要分布于游离状态或蛋白质分子上的半胱氨酸分子上的残基。
半胱氨酸的前体物质是蛋氨酸，因而也是生物体中的半必须氨基酸。它在生物体内代谢的途径有①合成蛋白质②转化为谷胱甘肽③变成胱氨酸④变成牛磺酸⑤变为丙酮酸其中，半胱氨酸转化为蛋白质、谷胱甘肽、胱氨酸后，半胱氨酸分子中的巯基未遭到破坏。
半胱氨酸转化为牛磺酸后，当新的巯基化合物与牛磺酸作用时，又会重新拥有巯基。
只有当半胱氨酸转化为丙酮酸时，半胱氨酸分子中的巯基才会不可逆地被破坏。
综上所述，生物体内升高巯基的途径有二要么蛋氨酸或巯基物质吸收增多，要么巯基的破坏减少。
在癌组织局部，巯基的含量升高，生物体的其它部位则巯基含量不升高，从而提示在癌组织的局部，有某种因素，导致了巯基含量的升高。这个因素，便是外源性致癌因素。
可是外源性致癌因素，无论是生物因素，还是理化因素，均无直接为生物体提供巯基物，可见癌组织中巯基含量的升高是由于生物体内尤其是癌变组织中巯基的破坏减少所致。
而导致癌组织中巯基破坏减少的原因，则只能是致癌因素保护了巯基，阻止了巯基的破坏。
(二)巯基与双硫键的化学性质首先看看巯基的化学性质R-SH+Hg++→R-S-Hg-S-RR-SH+H2O2→R-SO3HR-SH+ICH2COOH (弱碱)/() R-S-CH2COOHR-SH+ICH2CONH2(弱碱)/() R-S-CH2CONH2R-SH+ (弱碱)/() R-S- R-SH+C6H5-ASO→ -C6H5R-SH+HASO→ R′-SH+R-S-S-R→R′-S-S-R+R-SH二硫键的化学性质R-S-S-R+R′-SH→R′-S-S-R+R-SHR-S-S-R+H2O2→2R-SO3H R-S-S-R+Hg++→R-S-Hg-1-R巯基的保护基因有-O-苄基 B2l对甲氧苄基 MBzl三苯甲酸 Trt
乙酰胺甲基 AcmS-苄基半胱氨酸总之，半胱氨酸分子上巯基，能与如下几类物质发生反应重金属盐类，如Hg++等。
烷基化剂，如ICH2COOH、ICH2CONH2、带活性的乙烯双键类等。
亚砷酸及其盐，如C6H5-A8O等。
氧化剂，如H2O2。
二硫化物。
真正重要的不在于与巯基反应的试剂之多少，而是在于这些巯基试剂多数是强烈的致癌剂，如ICH2COOH、ICH2CONH2、亚砷酸盐、乙烯亚胺等。
因此，探讨外源性致癌因素与巯基的关系，对于揭示癌症之病因具有重大的科研价值。
(三)放射性因素之致癌机制自从Frieben(1902)和汉堡X线管工厂观察发现了第一例手背部皮肤癌以来，有关X射线致癌的报导愈来愈多，以致各国都建立了严格规定的强制性措施来预防X射线的有害作用。至今，X射线导致癌症的理论已不再受到任何怀疑。
具有放射性的物质的致癌作用也相继由国外学者证实。1933年，苏联一位从事放射性物质工作的医生(从事该工作的25位人员)的手指甲床发生了癌性溃疡;此后，苏联学者H.H彼得洛夫等，在猴子胫骨中植入镭，证实了其致癌性;法国学者Sabin在家兔身上注入氯化镭，取得了相同的结果。如今，不仅发现镭是致癌物，就连放射性P32、I131、Sr90、Ag110等的致癌作用，也一一得到了证实。1946年日本广岛原子弹爆炸，在距爆炸中心5KM范围内引起白血病极高的发病率，至今使人心有余悸。
日光的致癌作用，研究得也十分详细。Unna(1894)报道，阳光是决定性的致癌物，阳光中的紫外线部份，是这种致癌作用的原因。Profirow(1965)报道，在保加利亚的农民中，皮肤癌占有肿瘤的72%，那里的农民经常暴露于阳光下耕作。Roffo(1932-1933)、A.B.BaπOB(1939)发现，在实验笼中饲养小白鼠时，向阳一面的动物比日光照不到的动物皮肤癌的发病率要高得多，如在笼子表面装有滤除紫外线装置后，动物不产生肿瘤，苏联学者还发现，水银石英灯的紫外线比日光的致癌作用强。近代的科研证明，具有致畸、致变、致癌作用的射线剂量，是在1-5Rad之间，此一点，已在谷酰之《肿瘤放射治疗学》中有详述。
虽然射线是致癌因素，但放射治疗则是当前十分重要的癌症治疗措施，这是什么原因呢？原来用于治疗的射线剂量，是大剂量;而诱发肿瘤的射线剂量，则是小剂量。射线剂量的不同，导致生物体内的变化也不同。
大剂量的射线主要作用于生物大分子，尤其是破坏了DNA、RNA分子，导致细胞死亡。生长旺盛的细胞尤其是癌细胞，对于射线尤为敏感。因此，用于治疗目的的大剂量射线，不仅杀死肿瘤组织细胞，同时也损伤了照射部位的生长旺盛的正常细胞，特异性不大，负作用大。
小剂量的射线(1-5γad)作用于生物体时，对于小分子物质尤为敏感，尤其是水分子，作用之结果，使在生物体内产生大量的自由基，如H2O2、RO等。
H2O2作为自由基最重要的一种，既分布于细胞内液，也分布于细胞外液，在前面已经提到R-SH+H2O2→R-SO3HR-S-S-R+H2O2→2R-SO3H
一方面，H2O2能够破坏细胞膜等，这是其导致生物细胞易衰老的原因;另一方面，H2O2对于巯基酶活性中心之-SH作用使之失活，也会促使细胞寿命缩短。
但是，对于H2O2的致癌机制来说，H2O2作用于二硫键的反应则是最重要的。第一，DNA polymerase β的活性中心含有二硫键，极易遭到H2O2的作用而出现不可逆抑制，从而失去其本身的功能，即失去对损伤或改变了的DNA的修复，导致基因突变;第二，H2O2对于所有的二硫键均会作用，其结果，必然导致-S-S-相对减少，-SH则相对过多，从而使细胞内形成-SH含量升高状态，于是，导致一个或多个细胞癌变的条件便成熟了。
射线致癌，归根结底离不开其与生物体内巯基及二硫键的相互作用。
(四)化学致癌物致癌机制Ⅰ.前言化学性致癌物分八大类①多环芳香烃polycyclic aromatic hydrocarbons PAH②黄曲霉素类③芳香胺类④亚硝胺类⑤直接作用的烷化剂⑥无机致癌物⑦植物成份⑧药物和激素D.Schmahc(1962)曾出版了《恶性肿瘤的发生、生长和化疗》，于1984年由林培中博士与唐慰慈教授译为中文。该书对于化学性致癌物的分类、致癌作用及致癌机制有极为详尽的描述。结合我们本书的目的，从与巯基的关系出发，我们对于该书的分类方法进行保留性的归纳后，重新分为如下几类①含活性乙烯双键类PAH、黄曲霉毒素、植物成份及少量芳香胺类;
②砷剂与亚硝胺类三价砷、三价氮、氨基团等;
③直接作用的烷化剂类④药物和激素类下面将分别介绍之。
(1)含活性的乙烯双键类植物成份，尤其是一些高等植物成份，也报道有致癌作用，有关这方面研究的工作不多，目前有代表性的且重要的一种是吡咯西啶生物碱，它的名称来自含氮的双环碱吡咯里西啶。天然存在的吡咯西啶生物碱对于试验性动物 肯定具有致癌作用，而且强生物活性的吡咯西啶生物碱必须在吡咯西啶骨架中的1，2位具有一个双键。可见，双键对其致癌作用之重要。
黄曲霉毒素是另一类致癌物，1960年英国发生了“火鸡怪病”，大量的火鸡、家禽死亡，引起了世界关注。后来证明是喂的巴西花生粉中有黄曲霉毒素(Aflatoxin)，并于1962-1965年阐明了其系列结构(见下页)。
这类化合物的特征是具有五个环组成的杂环结构骨架，它含有一个香豆素系统及和它合并的双呋喃系统。黄曲霉毒素B族还含有一个环戊烷环，G组则含有一个六元内酯环。
末端呋喃环上2，3位的双键对于黄曲毒霉的致癌作用有重要意义。许多实验结果得出结论末端呋喃环中不含双键的黄曲霉素类化合物不具致癌性，反之致癌。同时发现，末端呋喃环中有完整的乙烯双键的羟化黄曲霉素，致癌作用减弱，说明双键附近的羟基能减弱致癌性。
此处，我们只要记住在末端呋喃环中含乙烯双键的黄曲霉素化合物才致癌即可。
多环芳香烃(PAH)致癌作用的研究最早始于(1795年，Pott等发现煤焦油能引起扫烟囱工人患阴囊癌，他首先描写了人体肿瘤的出现，最早证明有致癌作用的化学物质是煤焦油中的PAH。实验性致癌研究也同样与这类物质呈相关关系，1915年日本yamagiwa和Ichikawa首次描写了癌变动物试验，他们将煤焦油涂刷家兔皮肤后观察到生成局部肿瘤。后来，Bloch与Dreifuss的研究指出，致癌活性集中于煤焦油中高沸点馏分，光谱分析指出PAH是活性成份。
PAH致癌作用的特点①几乎所有的致癌性代表物均为芳香族4，5或6环系统;②大部份致癌性PAH是菲的衍生物，但在菲环系统上至少还连有另一个芳香环才致癌;③根据电子密度的量子化学计算结果，致癌性的 PAH具有一个富电子的、有明显双键特征的高反应性键。在菲的基本骨架中，9，10键是特别富电子的，类似于一个游离的乙烯双键，其中有一个π电子对。
PAH的化学结构与致癌性见下页表，总之，只有PAH骨架上具类似乙烯双键者才致癌。
(2)砷剂与亚硝胺关于砷对于人体某些癌的生成意义的认识(Paris，Ayrton，Geyer)也可以追溯到十九世纪初。从历史上看，砷是我们发现的第一个有致癌作用的药物，是继煤焦油之后发现的第二个外源性致癌物。
早期应用三氧化二砷(Fowler氏溶液)治疗鳞屑病，据Fierz报道，262个病人中(均用过Fowler氏溶液)，40%出现了手掌握心角化过度症，8%转化成皮肤癌，并随剂量增加得癌率也增加。在30年代及40年代，三氧化二砷作为葡萄种植中的杀虫剂，使得许多果农经常出现由砷引起的恶性肿瘤，如皮肤癌、肝癌、支气管癌。
以上资料告诉我们一个事实砷剂是致癌物，具有致癌作用的砷剂是三价砷。至今许多专著中仍把砷作为无机致癌物归类，这不科学，因为三价砷是有机砷。
有机砷是十分重要的巯基试剂C6H5AsO+2R-SH→ AsC6H5+H2O因此，可以想象砷剂致癌与巯基的关系是多么的密切。如果将上面的化学方程式展开用结构式表示则为 从结构式中，可以看出与巯基发生作用的功能团是-As＝0。为什么一定要强调-As＝0与巯基的作用关系，主要是为了与亚硝基-N＝0的致癌作用相联系。三氧化二砷易溶于弱碱性液，其水溶液是亚砷酸或亚砷酸盐。
亚硝基化合物在上世纪末已为人们所知。当亚硝基化试剂(一氧化氮或亚硝酸HNO2)作用于含一个仲氮原子的化合物时，即生成N-亚硝基化合物。N-亚硝基化合物是最主要的化学致癌物其分子通式为 其中R可为烷基、芳基、酰胺基、芳胺基、烷氧基或芳氧基、R1与R2可以相同，也可以不同。典型的代表物是 无论亚硝酸盐还是N-亚硝基化合物，全部的致癌结构中均离不开亚硝基-N＝0，至于N-亚硝基化合物中的R，则多为巯基的保护剂中的功能基。
(3)芳香胺类致癌物Rehn(1895)首次指出，苯胺有致膀胱癌的作用。他发现从事生产染料品红的四名工人患上的膀胱癌。后来，英国Case、Pearson发现萘胺是更强的膀胱致癌物。当今的动物实验资料提出了很大一类的芳胺致癌物，主要引起动物发生膀胱、肝脏及胃肠道产生肿瘤。
芳香胺类是多环芳香烃的环系统上含有氨基构成，其致癌性远远超过多环芳香烃。因此，芳香胺类是特殊的多环芳香烃，一方面，PAH本身是致癌的，另一方面，氨基很容易由羟胺、亚硝基、硝基等基团经过代谢而互相转化，可被看作-NO对待，大大加强了其致癌性。这些转化的场所是肝脏。
直接作用致癌的烷化剂Druckrey(1970)实验并证实了下列物质的致癌性CH3I
(4)具有致癌性的药物D.Schmahl(1977)对由药物诱发的肿瘤从量的方面做了粗略估计，指出在世界范围内，约1/10000的癌瘤是由药物引起的，其中，砷剂500例，氯霉素30例，细胞抑制剂800例，非那西丁200例，保太松100例，乙烯雌酚250例，焦油软膏30例，可见药物对于肿瘤的发生不得不受到重视。
砷是最早知道的具有致癌作用的药物，已不再详述。乌拉坦(H2NCOOC2H5)作为孕酮的助溶剂，Nettleship(1943)Txnnerbaum等多次发现并证实其诱发动物实验性肿瘤;Corbett(1976)指出吸入性麻醉剂CH2Cl-O-CH2Cl及CH2＝CHCl是对人有作用的致癌物;Rossi L(1977)报道了大剂量苯巴比妥可致小鼠和大鼠的肝细胞瘤;Haltengren，N(1965)报道滥用非那西丁引起肾盂癌;Juhasz J(1957)首批观察到抗结核药物异烟肼能诱发动物肿瘤;Gardener W.U(1941)就发现乙烯雌酚可能具有致癌作用并后来证实其正确;抗癌药物，尤其是烷化剂类，不仅经实验研究，而且最近也经许多临床病例证明是致癌的。氮芥及乙烯亚胺的致癌作用，经实验证实已近50年。日本1929-1945年间生产芥子气的工人，呼吸道恶性肿瘤比普通居民高33倍，德国学者随后证实了日本学者的结果。德国学者自75年始，用多年时间证实环磷酰胺所致的实验性肿瘤与临床病人因治疗癌症而应用环磷酰胺或烷化剂后引起的肿瘤一样，即膀胱癌和白血病。
综上所述，药物能引起肿瘤已不再受到人们的怀疑，如此具有致癌作用的药物诱发肿瘤的环节，基本上同化学致癌物的机制相同。
十一、致癌因素作用于巯基而致癌的问题且不说病毒的致癌机制，由射线导致的生物体H2O2升高、化学性致癌物中的-ASO、-NO、带活性的双键结构、烷化剂等，均能或极可能地与巯基发生反应，从而对巯基进行修饰。事实上，我们也在试图把能否与巯基作用这一特征，做为鉴定外源性因素能否致癌的分水岭。
虽然如此，在我们的面前仍遗留下许多令人困惑的问题。如果说，上述因子均会作用于巯基，从理论上说，这些巯基已被修饰，结果则是导致巯基的摩尔数目减少;如果上述因素直接作用于巯基酶，其结果则是导致巯基酶的活性丧失，与我们设想的结果完全相反。
事实上，肿瘤组织中的巯基摩尔含量是升高的;肿瘤组织中巯基酶的活性是升高的，印木泉(1991)在对体外细胞培养诱变试验中，证实半胱氨酸具有抗突变作用，而照我们的理论，半胱氨酸应是诱变剂。种种以上表现，究竟是怎么回事呢？我们再回顾一下放射线的致癌性有确凿证据;
亚砷酸盐的致癌性有确凿证据;
亚硝胺类的致癌性有确凿证据;
带活性双键的PAH、Aflatoxin、植物成份的致癌性有确凿证据;
巯基酶活性在肿瘤患者时是高的，有确凿证据;
巯基的摩尔含量在肿瘤组织含量是高的，有确凿证据;
上述致癌物与巯基酶作用后的结果，是巯基酶活性的丧失，证据确凿;
那么，问题在哪里呢？很明显，在生物体内，致癌因素没有直接与巯基酶发生作用，只能是这样。证据有51.亚砷酸盐、亚硝胺在碱性状态下稳定。
2.巯基与烷化剂反应和与活性乙烯双键反应的条件是弱碱环境。
3.在人体，细胞外液PH为7.4，属弱碱环境，而细胞内液PH为7.0，属中性环境。
4.有关巯基酶与巯基试剂作用后失活的结论，均是体外实验时得出的结果。
5.印木泉有关半胱氨酸具有抗突变作用的结论也是在体外实验中获得的。
可见，在人体内，化学性致癌因素存在的部位及其与巯基反应的场所是在细胞外液。由于绝大多数酶是由细胞本身产生且分布于细胞内，因此，致癌性化合物并没有直接作用于巯基酶。
在细胞外液中的含巯基物质(主要是半胱氨酸)，与致癌性化合物发生反应产生复合物，在PH7.4的细胞外液中是稳定的，但是当这些复合物进入细胞后，由于PH为7.0，这些复合物就变得不稳定而解离，使半胱氨酸上的巯基游离，于是，细胞内形成了巯基摩尔数升高的状态。
可是，为什么肿瘤只发生于特定的组织和细胞呢？十二、肿瘤产生的组织部位的特异性肿瘤是个局部疾病。为什么生物体那么多的组织和器官，肿瘤只发生于某一部位或只发生于某种特定组织？如多发性神经纤维瘤病，为什么只发生于神经组织？又如消化道肿瘤，为什么有的发生于食道，有的发生于胃，有的发生于结肠，而有的发生于肝胆？首先，取决于致癌因素的作用方式和部位。如砷剂作为皮肤病的药物，仅在涂抹的局部产生癌变;又如用煤焦油涂抹兔耳，仅在涂抹区产生肿瘤;黄曲霉毒素多是通过消化道吸收，仅在肝脏产生肿瘤。
再是取决于致癌物的亲和性。如黑色对于射线的吸收能力最强，因此在由阳光等引起的皮肤癌中，黑色素瘤较多发且多为恶性，又如N-亚硝基化合物，在结构式为 时，主要产生肝脏肿瘤，而在结构式为 时，主要产生食道肿瘤。-NO决定了该类物质的致癌性， 的不同，则决定了其对组织的不同亲和性。
致癌物在体内的代谢及排泄途径，对于癌变的组织和器官有重要关系。有些芳香胺本身没有诱发泌尿系肿瘤的作用，经过肝脏代谢后从泌尿系排出时则表现出强致癌性。由于芳香胺类的-NH2可与-NO互相转化，肝脏是代谢的最重要的器官，肠道是体内芳香胺的发源地，因此，肠道产生-肝脏代谢-肾脏排泄途径，导致了芳香胺类主要诱发肠道、肝脏、肾脏、膀胱肿瘤的结果，虽然染料工人接触外源性芳胺机会增加，但是其产生肿瘤的组织和器官并无改变，改变的只是上述肿瘤发病率的增加。
十三、肿瘤产生的细胞特异性在人体，所有的组织和器官均会产生肿瘤，但并非所有的细胞均会癌变。由于成熟的神经细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞不发生分裂，这些细胞也不发生癌变。为什么同是神经组织，只有胶质细胞等发生癌变而成熟的神经元不癌变？为什么同是肌肉组织，平滑肌细胞会癌变而心肌、骨骼肌细胞不癌变？细胞的癌变与否由什么决定呢？张昌 (1987)在《生物化学》一书中，对结缔组织的生化进行了详细的描述，尤其是对胶原蛋白的代谢，尤为细致。文中指出各种能够合成胶原的细胞如下成纤维细胞成骨细胞破骨细胞成牙质细胞平滑肌细胞上皮细胞软骨细胞神经视网膜细胞脊索细胞内皮细胞为什么把胶原代谢和细胞的癌变联系起来？由于以下几个方面的原因1.在上述能够合成胶原的细胞，无一例外地会产生癌变。而不发生癌变的细胞(如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞)，均无合成胶原蛋白的能力。
2.良性肿瘤均有一层纤维包膜，该包膜主要成份是胶原纤维。恶性肿瘤对周围组织浸润性强，该包膜常不完整或缺乏，可见这层纤维包膜对于肿瘤的生长之重要性。这里有几个问题尚不明确胶原纤维包膜是肿瘤产生的还是瘤周正常组织产生的？恶性肿瘤的纤维包膜是不能产生还是生成后受到了酶的破坏？3.胶原旦白的生物合成分为细胞内过程和细胞外过程。细胞内合成过程包括①前α链的转录、翻译和翻译后修饰;
②前胶原的形成移位和分泌。
细胞外过程包括①前胶原两端前肽被切除，原胶原形成;
②原胶原分子内和分子间共价交联，即胶原纤维形成。
这里应该注意的是胶原纤维蛋白的氨基酸组成中并无半胱氨酸;而细胞内前胶原的N端和C端均有前肽片断，前肽的分子结构上含有丰富的由半胱氨酸组成的二硫键。前肽的链间二硫键是前α链装配成三股螺旋分子所必需的，抑制这种共价键的生成就会妨碍前胶原的生成，进而阻断胶原蛋白的合成。
当前胶原分子分泌至细胞外表面，N端和C端的前肽立即被酶切割掉，形成原胶原，再形成胶原纤维。
胶原蛋白的代谢过程说明①构成肿瘤包膜的胶原纤维来自肿瘤细胞。
②前肽是细胞外液中半胱氨酸的重要来源之一。
③细胞内抑制二硫键生成的因素(-SH含量升高)能抑制和阻断胶原蛋白的合成，恶性肿瘤之纤维包膜不完整或缺如极可能是癌细胞内巯基摩尔数目升高破坏了二硫键的形成而使胶原蛋白合成障碍，而不是由于纤维包膜被酶降解掉所致。
④能产生癌变的细胞对于半胱氨酸的通透性具有高度选择性。半胱氨酸的吸收，需要细胞膜上特有的载体才可以将之携带入细胞内。由于具合成胶原能力的细胞内有大量之含丰富半胱氨酸之前肽，可见此类细胞的膜上含有半胱氨酸载体蛋白，对半胱氨酸的通过有高度特异性。
综上所述致癌物的接触部位、吸收方式、亲和性以及代谢排泄方式等，决定了癌变发生的部位及组织器官，而半胱氨酸的通透性决定了癌变组织中的特定细胞。
如三氮烯(1-对硝基苯基-3，3-二甲基三氮烯) 由于对神经组织有高度亲和性，病变发生的部位主要是脑和外周神经系统。又因神经细胞无合成胶原能力，因而神经细胞对于半胱氨酸通透性差，癌变只能发生于其它细胞，尤其是胶质细胞。
即致癌物与巯基物形成复合物后，有双重选择组织特异性;
细胞特异性。
因此对癌内因的分析得出如下结论1.癌症是有内因的，内因是有范围的。
2.从整个自然界来观察，癌内因只分布于生物界。
3.从生物界来观察，癌内因分布于有分裂能力的细胞中。
4.从细胞水平观察，癌内因分布于生物大分子中。
5.从生物大分子水平观察，癌内因分布于蛋白质分子中。
6.从蛋白质分子水平观察，癌内因分布于参与蛋白质组成的半胱氨酸分子上。
7.从半胱氨酸分子水平看，癌内因取决于其分子上的巯基(-SH)和由之形成的二硫键(-S-S-)的比例关系。
8.从元素组成来看，癌内因最关键的元素是硫。
本发明在上述发现的基础上，进一步通过对巯基含量与癌变组织关系进行了测定。
实施例
一、标本来源及分组(一)脑瘤组 ①脑膜瘤 26例②胶质瘤Ⅰ级 10例③胶质瘤Ⅰ-Ⅱ级 10例④胶质瘤Ⅲ-Ⅳ级 10例(二)其它部位肿瘤组①脂肪瘤 11例②神经鞘瘤 13例③子宫肌瘤 12例④大肠癌 12例⑤胃癌 13例⑥乳腺癌 13例(三)动物移植性肿瘤①黑色素瘤组 13例②Lewis肺癌 13例③Slgo肉瘤 13例手术取肿瘤组织及瘤周正常组织约200-500mg，加入1ml生理盐水的玻璃匀浆管中电动匀浆，离心(2300×g，30分)，取上清液，-20℃冰箱储存待测，或液氮保存。
二、测定巯基的试剂及器材DTNB试剂，又称Elman试剂，即5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸，购自Fluka公司。
光吸收测定取自日本津岛公司生产的UV-2400分光光度仪。
三、巯基的定量巯基的定量采用5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸试剂(DTNB试剂)。操作如下
将肿瘤及瘤周正常组织提取液取20ul，与5ml1%十二烷基磺酸钠溶液混合，加入20ulDTNB溶液(3.96mg/ml 0.1N磷酸盐缓冲液pH7.0)，室温放置10分钟后测定412波长处的光吸收。
巯基的计算巯基的含量＝ (光吸收值)/(13600×样本量(mg)) ×50(μmol/mg)四、统计学分析采用均数±株准误差(X±Sem)表示，采用组间均数比较，用T检验判断比较差异的显著性，以P＜0.05＊为相差显著，P＜0.01＊＊为相差非常显著。
五、结果参阅
图1-3，从测定结果充分证明本发明者对癌内因的分析的正确性，为征服癌症提供诊断、治疗和预防的有力手段。
表1.人正常细胞与肿瘤细胞增殖周期的比较正常细胞 细胞周期GC 肿瘤细胞 细胞周期GC(小时) (小时)食管上皮 144 食管癌 250.8胃上皮 60 胃癌 80.8结肠上皮 24-48 结肠癌 22-125骨髓细胞 24-40 急性白血病 48-90
权利要求
1.一种癌内因的分析测定方法，其特征在于取肿瘤及瘤周正常组织提取液各20μl，分别与十二烷基磺酸钠溶液5ml混合，加入20μlDTNB溶液(3.96mg/ml，和0.1N磷酸盐缓冲液至PH7.0)，室温放置10分钟后，分别测定波长412处的光吸收；所得的总吸收值采用组间均数比较，用均数±标准误差(×±Sem)表示，用T检验判断比较差异的显著性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于以P＜0.05为相差显著，P＜0.01为相差非常显著。
全文摘要
本发明涉及对癌内因的分析以及对癌内因的测定方法。
文档编号G01N21/31GK1105453SQ94100840
公开日1995年7月19日 申请日期1994年1月12日 优先权日1994年1月12日
发明者路红社 申请人:路红社